Cover Page. Author: Kotimaa, Juha Title: Analysis of systemic complement in experimental renal injury and disease Issue Date:

Transkriptio

1 Cover Page The handle holds various files of this Leiden University dissertation Author: Kotimaa, Juha Title: Analysis of systemic complement in experimental renal injury and disease Issue Date:

2 chapter 9 244

3 Chapter 9 Nederlandse samenvatting English summary Suomenkielinen tiivistelmä 9 245

4 chapter 9 NEDERLANDSE SAMENVATTING Het voortschrijdende onderzoek van de afgelopen decennia heeft geleid tot een dieper begrip van de rol van complement in nierschade en nierziekten. Dit heeft grote gevolgen voor hoe bestaande complement therapieën kunnen worden toegepast in de zorg voor patiënten en hoe toekomstige therapeutische interventies ontworpen kunnen worden om de klinische zorg te verbeteren. Op dit moment, treft chronische nierfalen (CNF) 10% van de westerse wereld. Afhankelijk van de kwaliteit van de zorg hebben tot 68 van de patiënten eindstadium nierfalen (ESNF), waar de standaard therapie dialyse en niertransplantatie is. Het is aangetoond dat het complementsysteem bijdraagt aan de omstandigheden die leiden tot ESNF, en in sommige gevallen is het de primaire oorzaak van nierschade, waaronder enkele auto-immuunziekten en glomerulonefritides. Bovendien, draagt complement bij aan ischemie/reperfusion injury (I/RI) tijdens orgaantransplantatie. Dit kan leiden tot delayed graft function en een toename van antilichaam-gemedieerde afstoting, daarbij fibrose bevorderend en schadelijk voor langdurige transplantaatfunctie. De huidige kennis van het complementsysteem is veel complexer dan voorheen, toen het complement systeem gezien werd als een relatief eenvoudige systeem aanwezig in serum, dat samen met antilichamen immuniteit verzorgde en bacteriën afweerde. Studies uit de afgelopen decennia hebben vastgesteld dat weefsel-specifieke en schade-induceerbare expressie van complement factoren samen met verschillende complement effectoren en regulatoren een belangrijke rol spelen in nierziekte en nierschade. Hoewel lokale complement productie, zoals bijvoorbeeld in de nier, een interessante rol speelt in verschillende omstandigheden, is serum nog altijd de belangrijkste bron van complement. Deze vasculaire, of systemische pool, kan extravasculaire ruimtes bereiken wanneer schade, ontsteking, of een ziekte de vasculaire integriteit vermindert. 246

5 Verschillende strategieën worden gebruikt om de relevantie van complement te onderzoeken in verschillende vormen van schade en ziekten. Complement inhibitoren, zowel in vivo depletie van complement factoren als therapeutische interventies, dragen allemaal bij aan complement onderzoek. Preklinische worden proefdieren uitgebreid gebruikt om de relevantie van complement tijdens gezondheid en in ziekten te bestuderen en beter inzicht te verkrijgen in de fundamentele mechanismen van hoe het complementsysteem werkt. Preklinische studies gebruiken ofwel natuurlijke- of genetisch gemanipuleerde complement deficiënte dieren, zowel weefsel-specifieke als complete deletie van complement factoren. De methodologie en de beschikbare speciale dier stammen hebben het samen mogelijk gemaakt om gedetailleerd te onderzoeken wat de bijdrage is van verschillende takken van het complementsysteem in gezondheid, ziekte en schade. Van alle experimentele modellen, omvatten muizen en ratten meer dan 75% van alle dieren gebruikt in preklinische studies. Echter, methoden voor complement analyse, welke ruim beschikbaar zijn voor onderzoek bij mensen, zijn minder ontwikkeld voor knaagdieren. Hemolytische testen, die deels overeenkomen, zijn de gouden standaard voor functionele complement analyse. Het probleem ermee is dat zij aanzienlijke hoeveelheden bloed voor analyse vereisen, die bij muizen vaak onhaalbaar zijn. Tot op heden hebben de soort-specifieke tests die beschikbaar zijn voor knaagdieren breed onderzoek van complement in preklinische modellen niet toegelaten. Het grootste deel van het gepubliceerde onderzoek richt zich op het histologisch bewijs van complement activatie. Hoewel deze benadering gedetailleerd begrip van complement activatie geeft, moeten dieren worden opgeofferd om weefsel te verkrijgen. Dit verhoogt ook het aantal dieren die nodig zijn voor een gedetailleerde studie of vermindert de tijdspunten die kunnen worden bestudeerd

6 chapter 9 In hoofdstuk 2 en 3 bespreken wij het probleem van een gebrek aan complement assays voor ratten en muizen en beschrijven wij de validatie van nieuwe methoden voor beide soorten. We ontwikkelden ELISA-gebaseerde standaarden functionele assays voor uitgebreide serumcomplement analyse en pasten deze toe in de context van nier I/RI. Aanzienlijke inspanning was gericht op het zo betrouwbaar en reproduceerbaar mogelijk maken deze assays en protocollen, vooral in het licht van het probleem dat het complementsysteem inherent labiel en gevoelig is voor activatie buiten het lichaam. Dit werk nam experimentele analyse van complement stabiliteit in vitro en analyse van verschillende types samples, zoals serum en plasma, mee. Onze resultaten tonen aan dat meerdere typen samples gebruikt kunnen worden, hoewel uit onze resultaten blijkt dat er een cross-talk is van complement en het stollingssysteem, met aanzienlijke C3 activatie verkregen wanneer het stollingssysteem wordt geactiveerd tijdens serumbereiding. Veel werk was gericht op de assaygevoeligheid, om de beperkende volume van muizen samples op te vangen, en om te zorgen deze testen specifiek zijn. Selectieve in vitro remming van het complementsysteem toonde aan dat de assays nauwkeurig zijn en dat de assays toepasbaar zijn voor het bestuderen therapeutische interventie van complement activatie in vitro en om inhibitie in vivo te valideren. Bewijs van complement activatie na experimentele nier I/RI in ratten werd aangetoond in hoofdstuk 2. Echter, de activering was alleen waarneembaar als een verhoogd serum sc5b-9 na reperfusie en door een kleine consumptie van alternatieve route (AP) functionele activiteit. Interessant was dat we vonden dat, na verloop van tijd, klassieke route (CP) specifieke activiteit verhoogde. Dat suggereert dat de ontstekingsreactie expressie en secretie van complement componenten in de circulatie induceerde. In dit rattenmodel van renale I/RI, is MBL, de initiator van de lectine route, beschreven als een van de belangrijkste oorzaken van de schade. Interessant is dat deze schade voornamelijk onafhankelijk van complementsysteem effectoren zoals het C5b-9 complex en C5a is. 248

7 Dit werd aangetoond als beperkt activering van systemisch complement in normale ratten en vermindering van renale I/RI schade als circulerend MBL voorafgaand aan reperfusie werd geremd. Onze resultaten waren in overeenstemming met eerdere studies met dit model, en daarmee kon de nauwkeurigheid en toepasbaarheid van de ontwikkelde methodologie voor de rat aangetoond worden. In tegenstelling tot het rattenmodel, bleek het muizenmodel van renale I/RI in hoofdstuk 3 meer complement-afhankelijke te zijn, hetgeen ook in overeenstemming is met eerdere studies. Onze resultaten toonden bewijs van acute complementactivering 24 uur na renale ischemie.oplosbare C3 activatie fragmenten werden verhoogd waargenomen en functionele activiteiten op het niveau van C9 activering suggereerden verbruik van serumcomplement componenten. Interessant was dat het verbruik duidelijk alleen op het niveau van C9 bleek te zijn en niet ter hoogte van C3. Dit kan betekenen dat ofwel voornamelijk terminal pathway componenten in significante hoeveelheden verbruikt worden of dat er meer rate-limiting stappen zijn in de C9- vergeleken met de C3-functionele testen, waardoor de C9 assay mogelijk gevoeliger is voor complement verbruik. Onze resultaten kunnen niet volledig bepalen welke route de grootste bijdrage levert, hoewel de AP het meeste effect op het niveau van C9 activering toonde. In hoofdstuk 4 bestudeerden we het effect van renale I/RI in een muismodel verder in detail, met een focus op een langere periode van observatie en de bijdrage van de C5aR en C5L2 receptoren bij nierschade. De resultaten van systemische veranderingen in complement, suggereren dat de complement activatie kortstondig is, terugkerend naar normale condities op dag 3 na I/RI, en dat de AP het meest prominent betrokken is. Muizen met C5aR en C5L2 deficiëntie hadden tubulaire schade en vertoonden significante verbetering volgens een aantal inflammatoire criteria, waarbij C5L2 deficiënte muizen de meest prominente verbetering toonden

8 chapter 9 Ontstekingscellen zoals neutrofielen dragen bij aan I/RI schade en worden aangetrokken door de beschadigde nieren door middel van anafylatoxinen zoals C5a. Onze resultaten tonen aan dat, zoals verwacht, C5aR deficiëntie chemotaxis van ontstekingscellen remt, welke deels de waargenomen bescherming verklaart. De C5L2 deficiëntie beïnvloedde chemotaxis niet, maar beïnvloedde wel de release van ontstekingsmediatiatoren, met mogelijk een verlaagd potentieel van ontstekingscellen om schade te veroorzaken. Om een beter inzicht te krijgen in het beschermingsmechanisme ten gevolge van C5L2 deficiëntie, voerden we nier I/RI in beenmerg chimeras uit, waar wild-type (WT) muizen getransplanteerd werden met C5aR en C5L2 beenmerg, en vice versa. Hier vonden we dat C5aR door leukocyten tot expressie gebracht wordt en dat C5L2 op leukocyten, samen met C5L2 dat door de nier tot expressie gebracht wordt, betrokken is bij schade geinduceerd door I/RI. Echter, expressie van renale C5aR droeg niet bij aan deze schade. Samengevat, blijkt uit onze resultaten dat C5L2 geen scavenger receptor is, zoals voorheen gesteld was, en dat zij een duidelijke rol sppelt in de renale I/RI, die zowel kan worden toegeschreven aan een rol bij inflammatoire- en niercellen. In hoofdstuk 5 hebben we de AP component properdine bestudeerd, de enige bekende positieve regulator van complement activatie, met in vitro aanwijzingen dat het kan fungeren als een herkenningsmolecuul en initiator voor AP activering. Preklinische studies hebben aangetoond dat Goodpasture syndroom, of anti-gbm, resulteert in activering van CP en ontstekingscellen, met daarbij een prominente bijdrage van AP. Verder hebben klinische studies aangetoond dat properdine in beschadigde glomeruli aanwezig is, maar deze studies konden niet onderscheiden of en hoe properdine bijdraagt aan de ziekte. Om beter het mechanisme en de bijdrage van de AP en properdine te begrijpen, gebruikten we een experimenteel muismodel van anti-gbm om het tijdsverloop van complement activatie op weefsel niveau te bestuderen. Serum bepalingen van complement twee uur na inductie van het model toonde een vroeg CP en AP verbruik en productie van C3 activering fragmenten. Echter, 250

9 prominente activering van de terminale route in de glomeruli was 24 tot 48 uur vertraagd en viel samen met een progressieve toename van properdine depositie. Verder onderzoek met properdine- en C3-deficiënte muizen toonde dat properdine deficiëntie leidt tot vermindering van acute complement activatie en, belangrijker nog, dat properdine bindt aan de beschadigde glomeruli onafhankelijk van bekende liganden zoals C3 en IgG. Voor zover wij weten is dit het eerste directe in vivo bewijs van de veronderstelde rol van properdine als een AP herkenningsmolecuul. Uitgebreide tests met muizen tijdens de test ontwikkelingsfase in hoofdstuk 3 leidde tot de verrassende uitkomst dat de functionele complement activiteit op het niveau van C9 activatie bijna afwezig was in vrouwelijke C57bl/6 muizen. Op basis van deze voorlopige bevindingen, werd het geslachtsverschil onderzocht in C57bl/6, BALB/c, en CD-1 muizen in hoofdstuk 6. Analyse van de belangrijkste componenten en functionele activiteiten van de initiatie routes en terminale route toonden dat in C57bl/6 en BALB/c-muizen het verschil in activiteit is toe te schrijven aan de in serum aanwezige hoeveelheden terminale route componenten zoals C6 en C9. Deze geslachtsspecifieke verschillen werden niet waargenomen bij CD-1 muizen. Bovendien suggereren voorlopige bevindingen met behulp van Western blotting dat C9 in C57bl/6 muizen posttranscriptionele modificatie en geslachtsdimorphisme kan vertonen, analoog aan C5. 9 Deze resultaten samen genomen onderstrepen het belang van het begrijpen van fundamentele variabelen, zoals geslacht, ras en leeftijd, omdat ze een grote invloed op de resultaten van preklinische studies kunnen hebben. Onze resultaten verklaren voor een deel de bevinding dat vrouwelijke muizen veel beter bestand zijn tegen nier I/RI dan mannelijke muizen. Zoals in hoofdstuk 3 en hoofdstuk 4 te zien was, dragen systemisch complement, en vooral de terminale route, aanzienlijk bij aan het experimenteel muismodel van renale I/RI. 251

10 chapter 9 De sterk verminderde terminal route bij vrouwelijke muizen kan hierbij deels de geslachtsspecifieke bescherming tegen renale I/RI verklaren. Bovendien hebben deze resultaten gevolgen voor het vertalen van de resultaten verkregen met vrouwelijke muizen, aangezien het complement systeem een centraal onderdeel is van zowel het aangeboren als het adaptieve immuunsysteem en dergelijke drastische verschillen bij de mens niet zijn waargenomen. In hoofdstuk 7 onderzochten we de mogelijke betrokkenheid van complement in calorische restrictie geïnduceerde renale I/RI bescherming. Recente studies hebben aangetoond dat MBL niveaus worden beïnvloed door dieetbeperking en uit onze verdere analyses bleek dat ook terminale route activiteit en de terminal route componenten in serum worden verlaagd na dieet interventies. Verdere analyse van lever genexpressie suggereerde dat dieet specifiek genexpressie van terminal route componenten vermindert, welke het waargenomen verlies van serum complementactiviteit kan verklaren. Analoog aan de bevindingen in hoofdstuk 6 met vrouwelijke muizen, zouden deze resultaten deels de calorische restrictie gemedieerde bescherming tegen renale I/RI verklaren. conclusies en toekomstperspectieven De methodologische aspecten in dit proefschrift hebben een fundament gelegd voor meer nauwkeurigere en uitgebreidere studies van complement in de toekomstige preklinische knaagdiermodellen. De in het proefschrift beschreven bepalingen faciliteren de evaluatie van de verschillende aspecten van systemisch complement, met inbegrip van onderzoek naar de initiatie en terminale route consumptie, individuele analyse van complement factoren en componenten, en het meten van complement activatie fragmenten. Verder maakt de methode in vivo en in vitro evaluatie mogelijk van nieuwe therapeutica gericht op complement interventies. Ons werk heeft ook de aandacht gevestigd op details zoals sample handling en sample types om een betrouwbare analyse 252

11 te waarborgen. Wij stellen voor dat de keuze van het geslacht van de muis van groot belang is, omdat dit onbedoelde effecten kan hebben op de resultaten van het onderzoek, wat overwogen moet worden voordat de resultaten vertaald worden in de klinische setting. De methoden hier beschreven vereisen slechts minieme hoeveelheden bloed voor analyse, waardoor sequentiële bemonstering van bloed van individuele muizen mogelijk is, wat potentieel het aantal benodigde dieren vermindert en tegelijkertijd de hoeveelheid informatie die kan worden verzameld uit één experimenteel model vergroot. De ELISA-gebaseerde functionele activiteitsassays maken ook ligand studies mogelijk. Potentiële liganden die complement kunnen activeren worden hierbij geïmmobiliseerd op de ELISA-plaat, en vervolgens kan route specifieke complement activatie worden gekwantificeerd. Onze resultaten bevestigen eerdere bevindingen over de betrokkenheid van complement in experimentele renale I/RI met een MBL-gedomineerd rat model en een AP-gedomineerd muismodel. Hoewel de resultaten, hier en door anderen, suggereren dat therapeutische remming van serum complement kan leiden tot vermindering van de schade, zullen toekomstige studies de exacte kinetiek moeten vaststellen wanneer de tijdelijke complement activatie begint en waar deze het meest prominent is. Verder zijn ook aspecten van het lokale complement systeem, zoals complement receptoren, regulatoren en weefsel specifieke expressie van complement factoren, belangrijke variabelen om te overwegen. Ontdekking van lokale schade mechanismen, zoals de hier beschreven C5L2 gemedieerde schade, impliceert dat gelijktijdige targetting van zowel de systemische als lokale complement activatie nodig is om de renale I/RI gevolgen tijdens transplantatie te beperken. 9 Ook het eerste in vivo bewijs van properdine als herkenningsmolecuul kan toekomstige studies laten richten op het remmen van properdine binding om de activering van de AP in anti-gbm te verminderen dan wel in andere 253

12 chapter 9 condities waar complementactivering en properdine betrokken zijn. Toch zal het precieze moleculaire mechanisme waardoor properdine complement activatie in vivo kan sturen verder onderzocht moeten worden, inclusief de identificatie van de liganden op de beschadigde cellen. Toekomstige studies zouden ook de bijdrage van properdine in andere anti-gbm modellen, waar complement een grotere rol heeft dan in het acute één-staps model van onze studie, kunnen includeren. Samengevat, is het complement systeem een fascinerend en bedrieglijk complex systeem met gedefinieerde lokale en systemische aspecten. Tot op heden zijn slechts weinig aandoeningen behandeld met complement-specifieke therapie, wat waarschijnlijk zal veranderen als het inzicht in de fundamentele aspecten van complement functies in gezondheid en ziekte in preklinische studies verder zijn ontrafeld. 254

13 ENGLISH SUMMARY The incremental research of the past decades has resulted in a deeper understanding of the role of complement in renal injury and disease. This has major implications on how existing complement therapies might be applied to patient care and how future therapeutic interventions should be designed to improve clinical care. Currently, chronic kidney disease (CKD) affects 10% of western population. Depending on the quality of care, up to 68 out of patients have endstage renal disease (ESRD), where the standard therapy is dialysis and renal transplantation. The complement system has been shown to contribute to the conditions leading to ESRD and in some cases is the primary cause of renal damage, including some renal autoimmune diseases and glomerulonephritides. In addition, complement contributes to ischemia/reperfusion injury (I/RI) following organ transplantation. This can lead to delayed graft function as well as increase antibody-mediated rejection, thereby promoting fibrosis which impairs long-term graft function. The current understanding of the complement system is far more complex than the traditional view, where the complement system is a relatively simple serum-based system augmenting antibody-based immunity and fighting off bacteria. Studies from the past few decades have established that tissue-specific and injury-inducible expression of complement factors together with different complement effectors and regulators play an important role in renal disease and injury. Although local complement pools, such as intrarenal complement, play an interesting role in different conditions, the serum is still the main source of complement. This vascular, or systemic pool, can reach extravascular spaces whenever injury, inflammation, or disease reduces vascular integrity. 9 Different strategies are used to investigate the relevance of complement in injury and disease. 255

14 chapter 9 Complement inhibitors, in vivo complement factor depletion, and supportive therapeutic interventions all contribute to complement research. In preclinical setting, experimental animal models are used extensively to study the relevance of complement to health and disease and to better understand the fundamental mechanisms of how complement system works. Preclinical studies use extensively either naturally or genetically engineered complement deficient animals with either tissue specific or complete deletion of complement factor gene expression in all host cells. Together the methodology and available special animal strains have allowed detailed investigation of the contribution and function of the different branches of complement system in health, disease, and injury. Of all the experimental models, mice and rats comprise more than 75% of all animals used in preclinical studies. However, methods for complement analysis, which are abundantly available for humans, are less developed for rodents. Haemolytic assays which do share some compatibility are the golden standard of functional complement analysis. The problem with them is that they require considerable amount of blood for analysis, which in case of mice may be prohibitive. To date, species-specific assays available for rodents do not allow broad investigation of complement in preclinical models. Most of the published research focuses on the histological evidence of complement activation. Although this approach is indispensable for detailed understanding of complement activation, animals have to be sacrificed to obtain tissue. This either increases the number of animals required for detailed study or reduces the time points that can be studied. In chapter 2 and chapter 3 we addressed the issue of lacking complement assays for rats and mice and described the validation of fit for purpose methodology for both species. We developed ELISA-based standard and functional assays for comprehensive serum complement analysis and applied them in the context of experimental renal I/RI injury. Considerable effort was directed on making the use of these assays and protocols as reliable and reproducible as possible, 256

15 especially in the light of the problem that the complement system is inherently labile and prone to activate accidentally. Our work with the assays included experimental analysis of complement stability in vitro and analysis of different sample types such as serum and plasmas. Our results show that multiple sample types can be used, although our results demonstrated the cross-talk of complement and the coagulation system, with significant C3 activation resulting when the coagulation system is activated during serum preparation. A major effort was focused on the assay sensitivity to accommodate the limiting sample availability in mice and ensuring these assays would be specific. Selective in vitro inhibition of complement system demonstrated that the assays are accurate and that the assays are applicable for studying therapeutic intervention of complement activation in vitro and to validate inhibition in vivo. Evidence of complement activation after experimental rat renal I/RI was demonstrated in rats in chapter 2. However, the activation was only observed as an increased serum sc5b-9 following reperfusion and by minor consumption of alternative pathway (AP) functional activity. Interestingly we also observed that over time classical pathway (CP) specific activities increased, suggesting that the inflammatory response induced expression and secretion of complement components in the circulation. In this rat model of renal I/RI, the initiator of lectin pathway MBL has been described as one of the main drivers of the injury. Interestingly, this injury is predominantly independent of complement system effectors, such as the C5b-9 complex and C5a. 9 This was demonstrated as limited activation of systemic complement in normal rats and attenuation of renal I/RI when circulating MBL was depleted prior reperfusion. Our results were clearly in agreement with previous studies using this model and thus demonstrated the accuracy and applicability of the developed methodology for rat. In contrast to the rat model, the mouse model of renal I/ 257

16 chapter 9 RI studied in chapter 3 was shown to be more complement-dependent, which is also in agreement with previous studies. Our results established evidence of acute complement activation at 24 h after renal ischemia, since soluble C3 activation fragments were elevated and functional activities at the level of C9 activation suggested consumption of serum complement components. Interestingly the consumption was clearly evident only at the level of C9 and not at the level of C3. This may indicate that either only terminal pathway components are consumed in significant quantities or that there are more rate-limiting steps in the C9 than C3 functional assays, possibly making the C9 assays more sensitive to complement consumption. Our results could not fully determine which pathway would be most involved, although AP showed most impact at the level of C9 activation. In chapter 4 we studied the impact of renal I/RI in a mouse model in further detail, with a focus on a longer observation period and the contribution of the C5aR and C5L2 receptors to renal injury. The results on systemic changes on complement suggests that the complement activation is transient, returning to normal conditions by day 3 after I/RI, and that AP is most prominently involved. Mice with C5aR and C5L2 deficiency had reduced tubular injury and showed significant improvement according to a number of inflammatory criteria, with C5L2 deficient mice having the most prominent improvement. Inflammatory cells, such as neutrophils, contribute to I/RI injury and are attracted to the damaged kidneys through anaphylatoxins such as C5a. Our results show that, as expected, C5aR deficiency inhibits the inflammatory cell chemotaxis, which partly explains the observed protection. The C5L2 deficiency did not impact chemotaxis, but impacted the release of effectors, possibly lowering the potential of inflammatory cells to cause injury. To better understand the protective mechanism stemming from C5L2 deficiency, we 258

17 performed renal I/RI in bone marrow chimeras, where wild-type (WT) mice were transplanted with C5aR and C5L2 bone marrow, and vice versa. Here we found that leukocyte-expressed C5aR and C5L2 together with renal-expressed C5L2 mediate injury during I/RI. However, renal expression of C5aR did not contribute to the injury. Together our results show that C5L2 is not a scavenger receptor as previously postulated and that it has a clear role in renal I/RI, which can be attributed to distinctive roles with inflammatory and renal cells. In chapter 5 we studied the AP component properdin, which is the only known positive regulator of complement, with in vitro indications that it may act as a pattern recognition molecule and initiator for AP activation. Preclinical studies have established that Goodpasture syndrome, or anti-gbm, has autoantibody-directed activation of CP and inflammatory cells, with prominent contribution from AP. Furthermore, clinical studies have shown that properdin is present in the injured glomeruli, but these studies could not distinguish whether and how properdin contributes to the disease. To better understand the mechanism and contribution of the AP and properdin, we used an experimental mouse model of anti-gbm to study the time course dynamics of complement activation at tissue level. Serum determinations of complement two hours after model induction showed an early CP and AP consumption and generation of C3 activation fragments. However, in the glomeruli prominent activation of the terminal pathway was delayed 24 to 48 hours and coincided with progressive increase of properdin deposition. 9 Further studies using properdin- and C3-deficient mice showed that properdin deficiency leads to attenuation of acute complement activation and, importantly, that properdin binds the injured glomeruli independent of known ligands such as C3 and IgG. To our knowledge this is the first direct in vivo evidence of the postulated role of properdin as an AP pattern recognition molecule. 259

18 chapter 9 The extensive testing of mice during the assay development phase in chapter 3 resulted in the surprising finding that the functional complement activity at the level of C9 activation was almost absent in female C57bl/6 mice. Based on these preliminary findings, the gender difference was investigated in C57bl/6, BALB/c, and CD-1 mice in chapter 6. Analysis of the main components and functional activities of the initiation pathways and terminal pathway revealed that in C57bl/6 and BALB/c mice the activity difference is explained by limiting amounts of terminal pathway components, such as C6 and C9, in serum. This gender-specific difference was not observed with CD-1 mice. Furthermore, preliminary findings using Western blotting suggest that C9 in C57bl/6 mice may present posttranscriptional modification gender dimorphism in analogy to C5. Together these results underline the importance of understanding the fundamental variables, such as gender, strain, and age, as they can have a major impact on the outcome of preclinical studies. Our results explain in part the finding that female mice are far more resistant to renal I/RI than male mice. As observed in chapter 3 and chapter 4, the systemic complement, and especially the terminal pathway, significantly contributes to the experimental mouse model of renal I/RI. Here, the strongly reduced terminal pathway in female mice may in part explain the gender specific protection against renal I/RI. Furthermore, these results have implications in translating results acquired with female mice, as the complement system is a central component of both innate and adaptive immune systems and similar drastic differences have not been observed in humans. In chapter 7 we investigated the possible involvement of complement in dietary restriction induced renal I/RI protection. Recent studies established that MBL levels are impacted by dietary restriction and our further analysis 260

19 showed that also terminal pathway functional activity and the terminal pathway components in serum are reduced after dietary intervention. Further analysis of liver gene expression suggested that diet specifically reduces gene expression of terminal pathway components, which would explain the observed loss of serum complement activity. In analogy to the findings in chapter 6 with female mice, these results would in part explain the dietary restriction mediated protection against renal I/RI. conclusions and future perspectives The methodological aspects in this thesis have established groundwork for more accurate and comprehensive studies of complement in future preclinical rodent models. The assays described in the thesis allow evaluation of different aspects of systemic complement, including investigation of the initiation and terminal pathway consumption, individual analysis of complement factors and components, and measurement of complement activation fragments. Furthermore, the methodology allows the in vivo and in vitro evaluation of novel complement therapeutics. Our work here has also drawn attention to details such as sample handling and sample types to ensure reliable analysis. We propose that the choice of mouse gender is of major importance, as this can have inadvertent impact on the study results, which needs to be considered before results are translated into clinical setting. 9 The methodologies described here require only minute amounts of blood for analysis, allowing sequential sampling of blood from individual mice, which potentially reduces the number of animals needed and at the same time increases the amount of information that can be gathered from a single experimental model. The ELISA-based functional activity assays also allow basic ligand studies. Potential ligands which may activate complement are immobilised on the ELISA-plate surfaces, and subsequently pathway specific complement activation can be quantified. 261

20 chapter 9 Our results confirm previous findings on the involvement of complement in experimental renal I/RI with an MBL-dominated rat model and an APdominated mouse model. Although the results here and by others suggest that therapeutic targeting of serum complement may lead to attenuation of injury, future studies will need to establish the exact timeframe where the transient complement activation begins and is most prominent. Furthermore, the aspects of local complement, such as complement receptors, regulators, and tissue specific expression of complement factors, are all important variables to consider. Discovery of the local injury mechanisms, such as the C5L2 mediated injury described here, will allow simultaneous targeting of both the systemic and local complement to mitigate the impact of renal I/RI on transplantation. Similarly, the first in vivo evidence of properdin as a pattern recognition molecule may allow future studies to focus on targeting properdin binding to diminish the activation of the AP in anti-gbm and in other conditions where complement activation and properdin are involved. However, the exact molecular mechanism by which properdin may direct complement activation in vivo will need further work, including identification of the ligands on the injured cells. Also, future studies could include evaluation of the contribution of properdin in other anti-gbm models where complement has more prominent role than in the acute, one-step model used in our study. Together, the complement system is a fascinating and deceptively complex system with defined local and systemic aspects. To date only few conditions have been successfully treated with complement specific therapeutics, which is likely to change as the understanding on the fundamental aspects on its function and contribution to health and disease emerge from preclinical studies. 262

21 SUOMENKIELINEN TIIVISTELMÄ Komplementtijärjestelmän toiminnasta ja roolista munuaistaudeissa on saatu tasaisesti lisää tutkimustietoa viimeisten vuosikymmenten aikana. Lisääntyneellä tiedolla on huomattava merkitys, kun mietitään olemassa olevien komplementtilääkkeiden käyttöä munuaistautien ja vaurioiden hoidossa ja pohditaan, miten komplementtijärjestelmän ei-toivottua aktivaatiota voitaisiin parhaiten estää tai hoitaa tulevaisuudessa. Tällä hetkellä 10 % länsimaisesta väestöstä sairastaa kroonista munuaisten vajaatoimintaa (CKD), minkä seurauksena hoidon laadusta riippuen 68/ potilaan munuaisten toiminta pettää, jolloin ainoa hoitovaihtoehto on dialyysi ja munuaissiirre. Komplementtijärjestelmä on osallisena useissa CKD:hen johtavissa taudeissa, ja joissain tapauksissa, kuten eräissä munuaistulehduksissa ja autoimmuunitaudeissa, komplementtijärjestelmä on pääsyy munuaisten vaurioitumiseen. Lisäksi komplementtijärjestelmä aktivoituu iskeemisen reperfuusiovaurion (I/RI) seurauksena, jolloin siirteen virkoaminen viivästyy, arpeutumisen (fibroosin) määrä lisääntyy ja siirre altistuu vasta-ainevälitteiselle hylkimisreaktiolle. Tämä heikentää siirteen toimintakykyä. Nykyaikainen näkemys komplementtijärjestelmästä on huomattavasti monitahoisempi kuin perinteinen käsitys, jonka mukaan kyseessä on seerumin proteiinien muodostama bakteereita tappava ja vasta-aineiden toimintaa vahvistava järjestelmä. Viime vuosikymmenten aikana koostettu tutkimustieto on osoittanut, että munuaisvaurioissa ja -taudeissa kudoksille ominainen komplementtiproteiinien tuotanto, vaurioiden aiheuttama komplementtiproteiinien erityksen paikallinen lisääntyminen sekä komplementtisäätelijät ja -effektorit ovat olennaisessa osassa erilaisten vaurioiden muodostumisessa. 9 Vaikka kudosten, kuten esimerkiksi munuaisten, erittämällä lähikomplementtijärjestelmällä on keskeinen rooli monissa eri taudeissa ja vaurioissa, 263

22 chapter 9 komplementtijärjestelmän komponenttien päälähde on kuitenkin seerumi. Verenkierron (systeeminen) komplementti vaikuttaa myös verenkierron ulkopuolella tilanteissa, joissa vaurio, tulehdus tai tauti heikentää verisuoniston normaalia läpäisevyyttä ja mahdollistaa komplementtiproteiinien pääsyn kudoksiin. Komplementtijärjestelmän osuutta taudeissa ja vaurioissa tutkitaan erilaisilla menetelmillä. Keskeisiä menetelmiä ovat esimerkiksi komplementtiestäjät, komplementtiproteiinien poistaminen tai niiden toiminnan estäminen vastaaineiden avulla sekä komplementtiaktivaatioon vaikuttavat tukevat hoitomuodot. Prekliiniset kokeelliset eläinmallit ovat olennaisessa osassa, kun tutkitaan komplementtijärjestelmän osuutta taudeissa ja vaurioissa. Lisäksi niitä käytetään, kun tutkitaan komplementtijärjestelmän mekanismeja ja sen eri osien toimintaa. Prekliinisissä tutkimuksissa käytetään usein joko luontaisesti tai geneettisesti muokattuja komplementtipoikkeavia eläinlinjoja, joilta komplementtigeeni puuttuu kokonaan tai vain tietystä kudoksesta. Menetelmiä yhdistämällä voidaan tutkia tarkasti, miten komplementtijärjestelmän eri haarat vaikuttavat normaalisti, vaurioissa ja taudeissa. Yli 75 % kaikista prekliinisissä tutkimuksissa käytettävistä eläinmalleista koostuu hiiristä ja rotista. Komplementtianalyysiin käytettäviä menetelmiä on laajalti saatavissa ihmisille, mutta niitä on kehitetty vain rajoitetusti hiirille ja rotille. Hemolyyttiset analyysimenetelmät ovat komplementtianalyysin perusmenetelmiä ja soveltuvat osin myös jyrsijöiden tutkimiseen. Niissä hankaluutena on kuitenkin tarvittavan verinäytteen määrä, mikä aiheuttaa ongelmia etenkin hiirien kohdalla niiden pienen koon vuoksi. Tällä hetkellä lajikohtaisia tutkimusmenetelmiä on niin vähän, ettei yksityiskohtainen komplementtitutkimus ole mahdollista prekliinisissä kokeellisissa eläinmalleissa. Suurin osa julkaistuista tutkimuksista on keskittynyt histologiseen määrittelyyn, jossa komplementtijärjestelmän aktivaatiota tutkitaan kudostasolla. Komplementtijärjestelmän aktivaation tutkiminen kudostasolla on keskeisen tärkeää, mutta eläimet joudutaan lopettamaan kudoksen keräämistä 264

23 varten. Komplementtiaktivaation seuraaminen tällä tavalla vaatii huomattavan määrän koe-eläimiä tai sitten seurattavien aikapisteiden määrää joudutaan rajoittamaan. Vastataksemme analyysimenetelmien puutteeseen kehitimme kappaleessa 2 ja kappaleessa 3 rotille ja hiirille soveltuvia ELISA-menetelmiä. Kehitimme sekä tavallisia että funktionaalisia mittausmenetelmiä ja sovelsimme niitä munuaisen iskeemisen reperfuusiovaurion tutkimiseen. Pyrimme varmistamaan, että menetelmät ja protokollat olisivat mahdollisimman luotettavia ja toistettavia, etenkin koska komplementtijärjestelmä on luontaisesti herkkä ja altis aktivoitumaan väärin käsiteltäessä. Tutkimme lisäksi komplementin in vitro säilyvyyttä ja erilaisten näytetyyppien soveltuvuutta komplementtimittausten tekemiseen. Tutkimustuloksemme osoittivat, että komplementin tutkimiseen voi käyttää useita erilaisia näytetyyppejä. Havaitsimme kuitenkin, että komplementti- ja hyytymisjärjestelmät voivat aktivoitua ristikkäin seeruminäytteitä valmistettaessa, mikä johtaa komplementti C3 -proteiinin aktivoitumiseen. Menetelmien herkkyyttä kehitettäessä otettiin huomioon hiiristä saatavien näytteiden pieni tilavuus ja menetelmien tarkkuus tutkittiin ja varmistettiin. Komplementtijärjestelmän eri haarojen valikoitu in vitro estäminen osoitti, että menetelmät olivat varsin tarkkoja ja että ne soveltuvat sekä in vitro komplementtiestäjätutkimuksiin että in vivo komplementtiestäjäkokeiden validointiin. 9 Komplementtijärjestelmän aktivoituminen munuaisten I/RI:n yhteydessä havaittiin rotilla kappaleessa 2. Aktivoituminen oli verrattain heikkoa, koska se havaittiin vain seerumin sc5b-9:n lisääntymisenä reperfuusion jälkeen ja lievänä vaihtoehtoväylän (AP) funktionaalisen aktiivisuuden kulumisena. Mielenkiintoista tuloksissa oli klassisen väylän aktiivisuuden tasainen nousu, mikä saattaa johtua tulehdusreaktion aiheuttamasta komplementtiproteiinien synteesin ja erityksen lisääntymisestä verenkiertoon. Käyttämässämme 265

24 chapter 9 munuais-i/ri:n rottamallissa lektiiniväylän aloittajalla MBL-proteiinilla on keskeinen rooli vaurion syntymisessä. Erikoista vauriossa on, että se on pääsääntöisesti riippumaton komplementtijärjestelmän aktivoitumisesta syntyvistä effektoreista, kuten C5a:sta ja C5b-9-kompleksista. Komplementtianalyysi tässä mallissa osoitti, että vaurion alkuvaiheessa systeeminen komplementti ei aktivoidu voimakkaasti tavallisilla rotilla, ja niillä rotilla, joilla MBL-proteiini oli poistettu verenkierrosta ennen kokeellista munuaisvauriota, munuaisten toiminta oli huomattavasti parempi. Uusilla menetelmillä kerätyt tulokset olivat selkeästi yhtenevät aikaisempien tutkimustulosten kanssa, mikä vahvisti menetelmien soveltuvuuden rottakokeiden analysointiin. Kappaleessa 3 hiirien munuais-i/ri:n havaittiin aktivoivan komplementtijärjestelmää enemmän kuin rottien kohdalla, kuten aiemmissakin tutkimuksissa on käynyt ilmi. Tutkimustulokset osoittivat, että 24 h munuais-i/ri:n jälkeen systeeminen komplementtijärjestelmä oli aktivoitunut, sillä C3-proteiinin aktivointikappaleiden määrä verenkierrossa oli lisääntynyt ja komplementtiväylien funktionaaliset aktiivisuudet olivat laskeneet C9-proteiinin aktivaation tasolla. Mielenkiintoista väylien funktionaalisten aktiivisuuksien laskussa oli, että se oli havaittavissa vain C9-proteiinin tasolla, mutta ei C3-proteiinin tasolla. Tämä voi mahdollisesti tarkoittaa, että vain terminaaliväylän komponentteja oli kulunut merkittäviä määriä komplementtiaktivaatiossa tai että C9- aktiivisuuteen perustuvat menetelmät sisältävät enemmän rajoittavia reaktioita kuin C3-menetelmät ja ovat näin ollen herkempiä komplementtiproteiinien kulutukselle. Tulosten perusteella ei voitu selittää täysin, mitkä väylät olisivat selkeimmin komplementtiaktivaation taustalla, vaikkakin vaihtoehtoväylä (AP) oli selkeimmin aktivoitunut komplementti-c9:n tasolla. Kappaleessa 4 munuais-i/ri:aa tutkittiin edelleen hiirimallissa. Tarkoituksena oli analysoida pidempiä aikasarjoja ja tutkia C5aR- ja C5L2-reseptorien 266

25 osuutta vaurion synnyssä. Tulokset systeemisen komplementin aktivaatiosta osoittivat, että komplementin aktivaatio on hetkellinen tapahtuma ja että systeeminen komplementti on palautunut normaaliksi kolmanteen päivään mennessä vaurion synnystä. Lisäksi AP oli selkeimmin osallisena komplementin aktivoitumisessa. Poistogeeniset hiiret, joilta puuttui C5aR- ja C5L2-reseptorit, olivat selkeästi vastustuskykyisempiä munuais-i/ri:lle, minkä osoitti useiden tulehdusmerkkiaineiden ja tubulusvaurioiden vähentyminen. Lisäksi C5L2- poistogeenisillä hiirillä vaurio oli huomattavasti lievempi normaaleihin hiiriin verrattuna. Tulehdussolut, kuten neutrofiilit, ovat olennainen osatekijä I/RI:n synnyssä, ja ne hakeutuvat vaurioituneisiin munuaisiin anafylatoksiinien, kuten C5a:n, avulla. Tuloksemme osoittivat, että C5aRreseptorin poistaminen estää tulehdussolujen kemotaksiksen, mikä osin selittää lievemmän munuaisvaurion. C5L2-geenin poistaminen puolestaan ei vaikuttanut tulehdussolujen kemotaksikseen, mutta vaikutti tulehdussolujen erittämien tulehdusvälittäjäaineiden vapautumiseen, mikä voi myös osaltaan selittää vaurion lieventymistä. Ymmärtääksemme paremmin C5L2-reseptorin poistamisesta syntyneen suojauksen mekanismia, kehitimme luuydinsiirtojen avulla kimeerisiä hiiriä: tavallisiin hiiriin siirrettiin luuydin poistogeenisiltä C5aR- ja C5L2-hiiriltä ja päinvastoin. Kun munuaisvaurio toteutettiin kimeerisillä eläimillä, havaitsimme, että vaurion syntyyn osallistuivat tulehdussolujen C5aR- ja C5L2-reseptorit sekä munuaisissa oleva C5L2-reseptori. Sen sijaan munuaisisten C5aR-reseptorilla ei ollut merkitystä vaurion synnyssä. Tuloksemme osoittavat selkeästi, että C5L-reseptori ei ole passiivinen kerääjäreseptori, kuten aikaisemmin on oletettu, ja että sillä on selkeästi havaittavia säätelyrooleja tulehdus- ja munuaissoluissa. 9 Kappaleessa 5 tutkimme vaihtoehtoväylän komponenttia properdiinia, joka on ainoa positiivinen komplementtijärjestelmän säätelijä. In vitro -tutkimusten perusteella se saattaa toimia myös hahmojentunnistajana, ja näin ollen se voisi aktivoida vaihtoehtoväylän (AP). Goodpasturen oireyhtymän eli anti-gbm:n prekliiniset ja kliiniset löydökset ovat osoittaneet, että AP aktivoituu ja että 267

26 chapter 9 taudille on ominaista autovasta-aineiden aiheuttama klassisen väylän (CP) ja tulehdussolujen aktivaatio. Lisäksi kliiniset tutkimukset ovat osoittaneet, että properdiinia löytyy vaurioituneista glomeruluksista tulokset eivät tosin ole pystyneet osoittamaan, onko properdiini olennainen vaurion syntymiselle. Ymmärtääksemme paremmin AP:n properdiinin roolin anti-gbm-vaurion synnyssä, tutkimme ja seurasimme komplementin aktivoitumista munuaisissa kokeellisella hiirimallilla. Tulokset osoittivat oletetun akuutin CP- ja APaktivaation, mikä havaittiin 2 h kokeellisen taudin alkamisesta seerumin komplementin väyläspesifisenä aktivaationa ja C3-aktivaatiofragmenttien määrän lisääntymisenä veressä. Glomeruluksissa komplementtijärjestelmän lopullinen aktivoituminen oli selkeästi viivästynyt ja tapahtui vasta samaan aikaan, kun properdiinin määrä lisääntyi vaurioituneissa glomeruluksissa. Jatkotutkimukset poistogeenisillä properdiini- ja C3-hiirillä osoitti, että properdiinipuutos vähentää seerumissa havaittavan akuutin komplementtiaktivaation määrää ja että properdiini voi sitoutua vaurioituneisiin glomeruluksiin ilman tunnettuja ligandeja, kuten C3:a ja IgG:tä. Meidän tietääksemme tämä on ensimmäinen suora in vivo -todiste properdiinin oletetusta roolista hahmoja tunnistavana molekyylinä. Kappaleessa 3 kuvatun menetelmän kehityksen osana mitattiin komplementtiaktiivisuutta erilaisissa hiirissä. Havaitsimme, että yllättäen C57BL/6- naarashiirillä komplementtiaktiivisuus oli C9:n tasolla liki olematon. Tämän alustavan havainnon perusteella sukupuolieroja tutkittiin edelleen C57BL/6-, BALB/c- ja CD-1 hiirillä kappaleessa 6. Komplementtijärjestelmän aktivaatioreittien ja terminaaliväylän pääkomponenttien analysointi osoitti, että C57BL/6- ja BALB/c-hiirillä aktiivisuuserot selittyvät terminaaliväylän komponenttien, kuten C6:n ja C9:n, vähäisellä määrällä seerumissa. Tätä sukupuolieroa ei kuitenkaan havaittu CD-1-hiirillä. Western-blot-analyysin perusteella C57BL/6-hiirten C9:llä on mahdollinen sukupuoliero proteiinien posttranskriptionaalisessa muokkauksessa, kuten on aikaisemmin havaittu 268

27 C5-proteiinin kohdalla. Kokonaisuutena tuloksemme muistuttavat siitä, että olennaiset muuttujat, kuten sukupuoli, eläinlinja ja ravitsemustila, voivat vaikuttaa suuresti prekliinisiin tutkimustuloksiin. Tulokset selittävät osin havainnon, että naarashiirillä on uroshiiriä huomattavasti suurempi sietokyky kokeellista munuais-i/ri-vauriota vastaan. Kuten havaitsimme kappaleessa 3 ja kappaleessa 4, verenkierron komplementti, ja etenkin terminaaliväylän komplementti, osallistuu munuaisvaurion syntyyn hiirimalleissa. Kappaleessa 6 kuvattu komplementtijärjestelmän sukupuoliero voi siis selittää osin naarashiirten sietokykyä I/RI-vauriota vastaan. Lisäksi havaittu ilmiö voi vaikuttaa naarashiirillä hankittujen tutkimustulosten käytettävyyteen, koska komplementtijärjestelmä on sekä sisäsyntyisen että hankitun immuniteetin keskeinen osatekijä ja koska vastaavaa sukupuolieroa ei ole havaittu ihmisillä. Kappaleessa 7 tutkimme komplementtijärjestelmän osuutta ravinnon rajoittamisella aikaansaadun munuais-i/ri:n sietokykyyn. Hiljattain julkaistut tutkimukset ovat osoittaneet, että seerumin MBL-tasot laskevat ravinnon rajoittamisen myötä, ja jatkotulokset osoittivat, että rajoittamisen seurauksena myös terminaaliväylän aktiivisuus ja komponenttien määrä laskevat. Jatkoanalyysi osoitti, että ravinnon rajoittaminen vaikuttaa maksan komplementtiproteiinien synteesiin laskemalla etenkin terminaaliväylän geenien ekspressiota, minkä seurauksena seerumin komplementtiaktiivisuus laskee. Kuten kappaleessa 6 havaittiin naarashiirillä, rajoitetulla ravinnolla aikaan saatu suojautuminen munuais-i/ri-vauriolta voi osin selittyä sillä, että terminaaliväylän aktiivisuus on heikentynyt. 9 yhteenveto ja tulevat tutkimukset Tässä väitöstyössä kehitetyt menetelmät muodostavat hyvän perustan tarkemmille ja laajemmille komplementtitutkimuksille prekliinisissä hiiri- ja rottamalleissa. Väitöksessä kuvattujen menetelmien avulla voidaan analysoida komplementtijärjestelmän eri osia, kuten määrittää komplementin aloitus- ja 269

28 chapter 9 terminaaliväylien aktiivisuus, sekä mitata yksittäisiä komplementtiproteiineja ja aktivaatiofragmentteja. Lisäksi menetelmien avulla voidaan analysoida uusien komplementtiestäjien toimivuus in vitro ja in vivo. Kehitystyön tuloksena syntyneissä protokollissa otetaan huomioon näytteiden käsittelyyn sekä näytetyyppeihin liittyviä vaaratekijöitä analyysejä suunniteltaessa. Lisäksi tuloksemme osoittavat, että sukupuolella on selkeä vaikutus etenkin komplementtijärjestelmään, mikä on huomioitava ennen tutkimusten suorittamista ja ennen tulosten perusteella tehtävien päätelmien soveltamista ihmistutkimuksiin. Väitöstyössä kehitetyissä menetelmissä tarvitaan vain vähäisiä määriä verta yksittäisiin analyyseihin, mikä mahdollistaa sarjoittaisen verinäytteiden ottamisen yksittäisiltä hiiriltä. Tämä osaltaan vähentää tarvittavien koe-eläinten määrää sekä kartuttaa tietomäärää, jota yksittäisestä eläimestä ja tautimallista voidaan kerätä. ELISA-menetelmään pohjautuvien funktionaalisten komplementtimittausten avulla voidaan lisäksi tutkia ligandeja yksinkertaisella tavalla. Komplementtijärjestelmän eri haaroja mahdollisesti aktivoiva ligandi sitoutetaan ELISA-levyn pinnalle, ja tämän jälkeen tutkitaan, miten ligandi aktivoi komplementtia ja komplementtiväyliä. Kokeellisilla hiiri- ja rottamalleilla kerätyt tulokset vahvistivat aikaisemmat tutkimustulokset siitä, että rottamallissa munuais-i/ri johtuu suurelta osin MBL-proteiinin vaikutuksesta ja että hiirillä AP-väylä on olennaisessa osassa. Vaikka tämän väitöskirjan ja muiden koostamat tulokset osoittavat, että seerumin komplementin estäminen voi johtaa vaurion vähenemiseen, tulevien tutkimusten tulee määrittää tarkasti, milloin komplementtiaktivaatio alkaa ja milloin se on voimakkaimmillaan. Lisäksi lähikomplementti, kuten reseptorit sekä kudoskohtainen komplementtitekijöiden eritys, on huomioitava komplementtiestäjien käyttöä arvioitaessa. Kun löydetään kudoskohtaisia vauriomekanismeja, kuten tässä väitöstyössä esitelty C5L2-välitteinen 270