Aseptinen työskentely

Transkriptio

1 Aseptiikka Lähes kaikki teolliset fermentoinnit ovat aseptisia ja perustuvat puhdasviljelmiin (= eivät ole sekapopulaatioita) Aseptisen työskentelyn avulla pyritään estämään vieraan organismin kasvu Kontaminaatioriski vaihtelee tyypillisesti 3-5 % välillä tuotteesta ja kasvualustasta riippuen. Raportoitua: Antibioottiviljely 2% tuontannoista kontaminoituu Hitaasti kasvavat eläinsolut rikkaalla alustalla, esim. β-inteferoni 17 % tuotannoista kontaminoituu Aseptiikka = 1) Fermentorin ja prosessin aseptinen suunnittelu 2) Sterilointi 3) Aseptiikka prosessin aikana Käytännön periaate: tehdään selväksi mitä prosessissa ja laitteissa kuuluu aseptiseen alueeseen ja mitä epäaseptiseen (esim. ilmalinjassa alueiden raja on steriilisuodatin) Pidä erillään termit steriili ja aseptinen Aseptinen suunnittelu koskee itse fermentoria ja siitä lähteviä ja siihen tulevia linjoja sekä laitteita (esim. on-line anturit, sekoitusakseli ), jotka ovat kosketuksissa kasvatusliemen kanssa sekä laitteiston aseptiseen käyttöön liittyviä ratkaisuja 1

2 Aseptinen työskentely Viljeltävien solulinjojen suojaaminen ristikontaminaatioilta sekä työntekijän suojautuminen mahdollisilta työhön sisältyviltä riskeiltä. Soluviljely voidaan suorittaa puhdastilassa. Puhdastilalla tarkoitetaan suljettua tilaa, jonka tarvittava puhtausluokitus voidaan järjestää esimerkiksi tuloilman suodatuksella (HEPA-suodattimet; High Efficiency Particulate Air filter) sekä ylipaineistuksella. lisänä voidaan käyttää ultraviolettivalaistusta suodattimessa tai tilassa jossa ei työskennellä Puhdastilaan tultaessa työntekijä pukee laboratoriota rajoittavassa sulkutilassa ylleen suojavaatetuksen, johon kuuluvat soluviljelytyöskentelyä varten varatut laboratoriotakki ja työjalkineet, kertakäyttöiset suojakäsineet sekä tarvittava muu suojavarustus (esim. hius- ja kasvosuojaimet). Ovet avautuvat vain yksi kerralla jotta paineistus toimii oikealla tavalla

3 Aseptinen työskentely Solujen käsittelyssä mikrobiologisessa työskentelyssä hyödynnetään usein siirrostuskaappia, joka voi olla pysty- tai vaakavirtauskaappi avoin tai suljettu. Turvaluokat I-III Tyypillinen ja yleisin laminaariilmavirtauskaappi suojaa viljelmiä kontaminaatiolta ja ihmistä mikrobeilta tai kemikaaleilta (luokka II) Muut: luokka I: suojaa vain ihmistä, luokka III: suljettu, alipaineinen hanskakaappi Tilassa on huolehdittava puhtaudesta ja asianmukaisesta desinfioinnista suorittamalla esim. pintojen pyyhintä etanolilla

4 Sterilointi Bioreaktori ja kaikki siihen lisättävät aineet (ravinteet, ilma) täytyy olla täysin steriilejä Reaktori Kasvuliuokset Ravinteet Ilma Vaahdonestoliuos Yhteet (näytteenotto) Tulee poistaa tai tuhota vieraat organismit ja itiöt Minimoidaan tuotteen häviö Täysin steriilejä olosuhteita mahdoton saavuttaa Tapauskohtaista, kuinka steriilejä olosuhteita vaaditaan Yleisin tapa steriloida kaasuja on käyttää suodattimia.

5 Sterilointimenetelmät Solujen tuhoaminen lämpö, kemiallinen käsittely, uv- tai gammasäteily, ultraääni, Solujen poistaminen suodattamalla Laboratoriossa autoklaavi Teollisuudessa lämpö- ja suodatussterilointi Autoklaavi UHT-sterilointilaite

6 Autoklavoitu bioreaktori kemostaattikasvatusta varten Laboratoriofermentorin valmistelu sterilointi, kalibrointi, näytteenotto:

7 Teollisten bioreaktoreiden sterilointi Lämpösterilointi Käytetään vesihöyryä Haasteellista rakentaa sterilointisysteemi reaktoriin Sterilointiaika yleensä tunteja Paine 2-3 bar (kylläinen vesihöyry C) Hitsatut liitännät oltava tasaisiksi kiillotetut Liitoksissa hyvään hygieniaan soveltuvia materiaaleja Vältettävä erillisiä tyhjiä tiloja, halkeamia, tms. Hyvä olla useampia venttiilejä steriilin ja ei-steriilin tilan välille Venttiilien oltava helppo puhdistaa, huoltaa ja steriloida Testataan ilmalla ennen käyttöä Havaitaan vuotokohdat ja mahdollisesti auki jääneet venttiilit 24 tunnin testi asennuksen ja mekaanisen korjauksen jälkeen 1/2 tunnin testi ennen sterilointia Doranissa: Industrial bioreactors for sterile operation are usually designed as steel pressure vessels capable of withstanding full vacuum and up to about 3 atm of positive pressure at 150 to 180C. Jos näin niin kyseessä tulistettua höyryä. Kylläinen höyry oli noin 10 bar.

8 Fermentorit - aseptiikka Aseptiikan kannalta keskeiset fermentorin kohdat ja ratkaisut niihin: 1. Ilma Sisääntuleva ja yleensä myös poistuva ilma steriilisuodatetaan Steriilisuodattimet steriloidaan höyryllä; lauhteet poistettava (lauhteenpoistin) Aseptisen alueen osalta ilmalinjat on steriloitava (höyryllä) Sisääntuleva ilma on puhtaampaa => enemmän suodatuspinta-alaa poistoilmalle Varalla olevat steriloidut suodattimet omissa linjoissaan suositeltavia Poistoilmalinja ja suodattimet steriloituvat fermentoria ja kasvatusalustaa steriloitaessa vain, jos niissä on kylläistä höyryä sterilointipaineessa ja lauhteet johdetaan pois 2. Sekoitusakseli Läpivienti kannessa (tai pohjassa) vaatii tiivisteen Yleisin ratkaisu on mekaaninen (1- tai 2-puolinen) liukurengastiiviste Tiiviste on steriloitava yleensä ennen fermentorin sterilointia, koska tiivistettä steriloitaessa sekoitusakseli ei saa pyöriä Isommissa fermentoreissa (> 15 L) tiivisteen läpi ajetaan paineella steriiliä vettä (esim. höyrystä lauhdutettua) 3. Anturit Esim. ph ja DO; omissa yhteissään tiivistettynä yhteen seinämään O-renkailla; myös anturin ja anturin suojaputken välinen tiivistys O-renkailla Antureihin voidaan liittää ns. ulosvetoputki, jonka avulla anturi voidaan vetää pois ja kalibroida tai vaihtaa (uudelle anturille tietysti sterilointi ensin putkessa)

9 Fermentorit - aseptiikka 4. Fermentorin kansi Puhdistuksen, korjausten yms. takia irroitettavissa Kansi laippaliitoksella; fermentorin runko-osassa esim. höyryura, jonka molemmilla puolilla O- renkaat 5. Venttiilit Erityisesti kalvoventtiilit sopivia aseptisiin kohtiin Pohja-, siirrostus- ja näytteenottoventtiileinä mäntäventtiilit höyryhuuhtelulla suositeltavia Varmistuttava, ettei muodostu taskuja, joihin voi jäädä epästeriiliä materiaalia (esim. pohjaventtiili) Palloventtiilejä ei suositella 6. Lisäyslinjat Steriloinnissa olennaista lauhteiden poisto (esim. pulssittamalla linjan venttiiliä) Sterilointi fermentorin steriloinnin yhteydessä 7. Kasvatusliemen poisto Pohjaventtiilin kautta, steriloidussa linjassa Voidaan käyttää rajapinnan katkaisijaa (esim. kartio, jossa neste ei kosketa seinämää, joka pidetään kuumana höyryvaipan avulla) 9

10 Puristusventtiili - Use of flexible sleeves or diaphragms so that the closing mechanism is isolated from the contents of the pipe and there are no dead spaces in the valve structure. -Rubber or neoprene capable of withstanding repeated sterilisation cycles is used to fashion the valve closure -Must be checked regularly for wear to avoid valve failure Figure Copyright 2012, Elsevier Inc. All rights Reserved.

12 Aseptiikka käytännön ratkaisuja Esimerkki: näytteenotto Esimerkki: ilmasuodattimen ja ilmastuslinjan sterilointi 12

15 Bioreaktorin erilaisia lämmitys- ja jäähdytyskeinoja - steriloinnissa myös suora höyryn syöttö (in situ erästerilointi) mahdollista - nestetilavuuden kasvu % kondensaatin vuoksi - höyryn oltava riittävän puhdasta metalli-ioneista tai orgaanisista aineista Figure 9.1 Copyright 2012, Elsevier Inc. All rights Reserved.

16 If the contents of the fermenter are well mixed, temperature gradients in the bulk fluid are negligible and the fermenter temperature is uniform at T F Figure 9.2 Copyright 2012, Elsevier Inc. All rights Reserved.

17 Sterilisation is also capable of destroying nutrients in the medium. To minimise this loss, holding times at the highest sterilisation temperature should be kept as short as possible. Figure Copyright 2012, Elsevier Inc. All rights Reserved.

18 Lämpösteriloinnin kinetiikka o o o o o Lämmityksen aikana pieni osa soluista tuhoutuu Sterilointiaikana merkittävä väheneminen Jäähdytyksen aika vielä hieman lisää Vakiolämpötilan jakso helppo laskea 1. asteen lämpökuolemiskinetiikka tavallinen (ei päde esim. bakteeri-itiöille lämmitysvaiheessa): rr dd = kk dd NN = dddd dddd r d on solujen kuolemisnopeus (min -1 ) N elinkykyisten solujen määrä k d on spesifinen kuolemisvakio (min -1 ) o Vakiolämpötilassa k d on vakio, jolloin jäljellä olevien solujen lukumäärä voidaan laskea NN = NN 0 ee kk ddtt eli lnnn = llllll 0 kk dd tt N 0 solumäärä vakiolämpötilajakson alussa t on aika (min -1 )

19 Lämpösteriloinnin kinetiikka o o o o Spesifinen kuolemisnopeus saadaan kuvaajasta lnn vs. t Kuten monet muut kineettiset vakiot, myös k d on lämpötilasta riippuva Arrheniuksen yhtälöä mukaillen saadaan: kk dd = AA ee EE dd/rrrr llll kk dd = llllll EE dd RR A on Arrheniuksen vakio 1 TT E d on lämpökuolemisen aktivoitumisenergia (J mol -1 ) R on ideaalikaasuvakio (J K -1 mol -1 ) T on lämpötila (K) E d -arvo voidaan laskea kun on tietoa k d -arvoista useissa lämpötiloissa. Lineaarisessa tapauksessa kuvaajasta lnk d vs. 1/T saadaan kulmakertoimena E d /R:

20 Kah oot! teko valmiita? Figure Copyright 2012, Elsevier Inc. All rights Reserved. Jos haluaa laskea solujen määrän lämmitysvaiheen lopussa N 1 ja jäähdytyksen jälkeen N f tarvitaan tieto lämpötilan muutoksesta ajan funktiona

21 Sterilointilaitteistoja Höyryn syöttöön ja jäähdytyssäiliöön perustuva jatkuvatoiminen sterilointilaitteisto Lämmönvaihtimiin perustuva jatkuvatoiminen sterilointilaitteisto

22 Figure Because of the extremely short contact times in continuous sterilisers compared with batch systems, there is a much greater risk that particles will not be heated thoroughly and will therefore not be properly sterilised. It is important that raw medium be clarified as much as possible before it enters a continuous steriliser Copyright 2012, Elsevier Inc. All rights Reserved.

23 Poikkeamaa tulppavirtauskäyttäytymisestä kuvataan aksiaalisella dispersiolla, joka kuvaa sekoittumista pitkin putken pituusakselia. Iso aksiaalinen dispersio heikentää sterilointitulosta

24 Missä tahansa lämpötilassa eli k d - arvossa ja sitä kautta Damköhler-arvossa sterilointitulos heikkenee merkittävästi kun Peclet-arvo laskee eli aksiaalidispersio D Z kasvaa. L=putken pituus u=lineaarivirtausnopeus k d =kuolemisvakio Da Pe N 2 /N 1 Copyright 2012, Elsevier Inc. All rights Reserved.

25 Lämpöä kestävien Bacillus stearothermophilus - itiöiden tuhoamisesta A) Behavior is normal first order kinetics B) The first straight portion of the curve mainly describes death of the organism of lower resistance and the second portion describes death of the more resistant one. C) This model would be adequate to describe the behavior of a nonhomogeneous suspension in which aggregates of two or more spores would coexist with isolated spores. D) This type of curves have been associated with the presence of uncountable dormant spores which could, during the heat treatment, be activated and then destroyed successively. Reactions of both activation and destruction would obey first-order kinetics

26 Huom! Eri aika-akselit

27 Steriilisuodattimia Laskostamalla kalvomateriaalia saavutetaan suuri suodatuspinta-ala Samantapaista kotelosuodatinta voidaan käyttää sekä liuosten että kaasujen steriilisuodatukseen

28 Ilman sterilointi Ilmassa on mikrobia kuutiometriä kohden, joista suurin osa on hiiva- ja homeitiöitä sekä gramnegatiivisia bakteereita Aerobiset tehdasprosessit täytyy ilmastaa Yleisin ilmastusnopeus on 0,1-0,7 vvm, yksikkö tarkoittaa ilmamäärää reaktorin kasvatustilavuutta kohti minuutissa. Yleisin tapa steriloida kaasuja on käyttää suodattimia. Käytetään myös kuumentamista, säteilyttämistä sekä elektrostaattisia menetelmiä Bioreaktoreista poistuva ilma on usein myös steriloitava bioreaktorista poistuva kaasu sisältää huomattavasti enemmän mikrobeja kuin syöttöilma

29 Suodattimet Kuitumaiset suodattimet Kalvosuodattimet Kotelokalvosuodattimet Kaasusuodattimet steriloitava Kaasujen steriilisuodattamiseen käytetyt suodattimet sisältävät esisuodattimia

30 Kuitumaiset suodattimet Materiaalit sitovat mikrobeja ja muita partikkeleita perustuu fysikaalisten efektien vuorovaikutuksiin Koostuvat useista päällekkäisistä kuitumatoista, paljon reikiä reikäisyysprosentti Yleisimmät valmistusmateriaalit ovat selluloosa, borosilikaatti, kvartsi ja polymeerikuitu. Haittapuolia herkkyys ilman kosteudelle suhteellisen huono keruutehokkuus alle mikrometrin kokoluokassa kanavoituu suurilla virtausnopeuksilla

31 Kalvosuodattimet Materiaaleina käytetään selluloosaa, nailonia tai polykarbonaattia Kotelomaiset suodatinpatruunat ovat joko polymeeripohjaisia tai keraamisia Suodatuspinta-ala perustuu kerroksiksi laskostettuun kalvomateriaaliin Membraanisuodattimilla on korkeat keräystehokkuudet sekä korkea paine-ero Edut huomattavasti pienempiä kuin kuitumaiset kalvot kotelokalvosuodattimet helppo uusia voidaan valmistaa liuottimia ja muita kemikaaleja kestäviksi