Tekopohjaveden bioteknisen valmistuksen tehostaminen: esiselvitys laajempaa hanketta varten

3.6.28 Tekopohjaveden bioteknisen valmistuksen tehostaminen: esiselvitys laajempaa hanketta varten Raportoitu aika: 1.12.27 3.6.28 Reija Kolehmainen, Tomi Lahtinen, Pertti Vuoriranta, Olli H. Tuovinen, Jaakko Puhakka Kemian ja biotekniikan laitos, Tampereen teknillinen yliopisto, PL 41, 3311 Tampere 1 Johdanto Tämän tutkimuksen tavoitteena oli kartoittaa suunnitteilla olevien Tavase Oy:n ja Turun Seudun Vesi Oy:n tekopohjavesilaitosten (Syrjänharjun ja Virttaankankaan imeytysalueet) luonnontilaiset bakteeriyhteisöt. Lisäksi tavoitteena oli testata menetelmiä mikrobiyhteisödynamiikan seurantaan tekopohjavesilaitoksilla myöhempiä tutkimuksia varten. Tutkimuksen avulla täydennettiin tekopohjavesiyhtiöiden olemassa olevaa kemiallista ja hydrogeologista aineistoa. Tutkimuksessa käytettiin LH-PCR- menetelmää (length heterogeneity analysis of PCR amplified 16S rdna), jonka avulla voidaan karakterisoida diversiteetiltään laajoja bakteeriyhteisöjä ajallisesti pitkäkestoisissa selvityksissä. Tutkimuksessa käytettiin Verbio Oy:n yhdessä Tampereen teknillisen yliopiston kemian ja biotekniikan laitoksen kanssa kehittämää biofilminäytteenotinta, sillä suurin osa pohjaveden mikrobeista on pinnoilla. Koska edustavien maaperänäytteiden saaminen mikrobiologista seurantaa varten on mahdotonta, voidaan biofilmikeräimien avulla kartoittaa pinnoille kiinnittyviä mikrobiyhteisöjä kontrolloidusti. Vesi- ja biofilmiyhteisöjen karakterisoinnin ohella hankkeessa seurattiin solumäärien ajallista vaihtelua. Tekopohjavesiyhtiön alkuperäisistä suunnitelmista poiketen Syrjänharjulla ei tämän hankkeen aikana toteutettu koeimeytyksiä, mistä syystä vertailevaa pohjaveden bakteeritutkimusta ennen ja jälkeen imeytyksen ei päästy tekemään. Tekopohjavesi kattaa tällä hetkellä maamme talousveden tuotannosta noin 12. Lähitulevaisuudessa tekopohjaveden osuus tulee kasvamaan, sillä Suomeen ollaan suunnittelemassa kahta Pohjois-Euroopan mittakaavassa suurta tekopohjavesilaitosta. Tekopohjavesiyhtiöt Tavase Oy ja Turun Seudun Vesi Oy suunnittelevat tekopohjavesilaitoksia, joiden vedenotto olisi selvästi olemassa olevia tekopohjavesilaitoksia suurempi (7 1 m 3 /vrk). Tekopohjaveden muodostuksessa maaperään kulkeutuu järviveden mukana huomattava määrä orgaanista ainesta luonnontilaisten olosuhteiden muuttuessa radikaalisti. Tällä on suuri vaikutus siihen, mitkä mikrobit maaperässä yleistyvät. Mikrobiyhteisöt sopeutuvat muuttuviin olosuhteisiin käyttäen luonnollista valintaa (selektio ja rikastuminen), geenimutaatiota, adaptaatiota ja horisontaalista geenien siirtoa. Veden imeytys ja mikrobitoiminta vaikuttavat myös harjun happitaseeseen, ph ja redox olosuhteisiin ja lämpötilaan, joilla puolestaan on suuri merkitys mm. raudan ja mangaanin biogeokemiallisiin reaktioihin akviferissa. Kemian ja biotekniikan laitoksen tähänastiset tutkimukset ovat osoittaneet mikrobien roolin olevan keskeisen orgaanisen aineksen poistumasta tekopohjavesilaitoksilla. Liuenneen orgaanisen hiilen poistumasta mitattuna biohajoamisen osuus oli tutkimuksissa 3 lämpötilasta ja hydraulisesta kuormasta riippuen. Mikrobeilla onkin keskeinen vaikutus orgaanisen aineen kohtaloon määritettäessä ja valvottaessa tekopohjavesimenetelmän toimivuutta pitkällä aikavälillä. Lisäksi tutkimukset ovat osoittaneet imeytettävän raakaveden mikrobiyhteisön muuttuvan radikaalisti veden virratessa hiekkapatjassa ja eroavan alueen luonnontilaisen pohjaveden mikrobiyhteisöstä. 1

Tämä esiselvitys osaltaan edesauttoi TEVA-hankkeemme valmistelussa Tekesin VESI-ohjelmaa varten keväällä 28. Tekesistä äskettäin tulleen ilmoituksen mukaan TEVA-hankkeemme on nyt saanut rahoituksen. LH-PCR menetelmä perustuu fylogeneettisiin tutkimuksiin soveltuvaan markkerigeeniin, joita on useampikin riippuen tutkimuksen tarkoituksesta. DNA tietopankeista löytyy kuitenkin eniten 16S markkerigeenin sekvenssejä. 16S geeni koodaa ribosomaalisen 3S rrna:n runkorakennetta, jolla on sekä rakenteellinen että funktionaalinen rooli muodostuvassa RNA-proteiinikompleksissa. Ribosomi puolestaan on proteiinien tuotannosta vastaava soluorganelli, jossa DNA:sta kopioitu lähetti-rna-nauha koodataan aminohapposekvenssiksi. Sillä on hyvin tärkeä tehtävä pro- ja eukaryoottisolussa ja tämän vuoksi sen mutaationopeus on hyvin pieni, varsinkin geenin konservoituneilla alueilla. Nämä alueet vastaavat yleensä jostakin tärkeästä rakenteesta tai toiminnosta, joissa mutaatio on yleensä vahingollinen. Näin ollen kaikilla bakteerilajeilla on konservoituneilla alueilla lähes sama DNA:n emäsjärjestys. 16S geenisekvenssissä on kuitenkin heterogeenisiä alueita, joissa on vaihtelevuutta bakteeriryhmien ja lajien välillä. Tilastollisesti katsoen tämä vaihtelu johtuu suurimmaksi osaksi pituuseroista (geenialueen insertiot ja deleetiot), eikä niinkään erilaisesta emäsjärjestyksestä. Tämä mahdollistaa pituuserottelun ns. universaaleilla alukkeilla, jotka PCR-reaktiossa kiinnittyvät kaikilla bakteerilajeilla samoille konservoituneille alueille ja monistavat väliin jäävän heterogeenisen alueen. Tässä tutkimuksessa 16S markkerigeenin 1 emäsparin () mittaisesta alueesta monistettiin n. 1/3 mittainen alue, joka vaihtelee välillä n. 46-6. Kun koko bakteeripopulaation DNA on monistettu, siinä on edustettuna kunkin lajin 16S DNA samassa suhteessa kuin lajin alkuperäinen DNA-pitoisuus on populaatiossa ollut. Tämä mahdollistaa kvantitatiivisen analyysin, jossa bakteeriryhmien suhteellisia määriä tarkastellaan pylväsdiagrammikuvaajassa (Suzuki et al. 1998, Tiirola et al. 23). EMBL (European Molecular Biology Laboratory) tietokannasta voidaan tehdä tietokantahaku käyttämällä universaalia alukeparia, jolloin kaikki tietokannan bakteerit (cultured and uncultured bacteria) ryhmittyvät pituusjärjestykseen. Tämän pituustaulukon avulla voidaan päätellä tietyn bakteeriryhmän esiintyminen esim. pohjavesi- ja biofilminäytteessä. DNA-tietokantojen jatkuvasti kasvaessa yhä useampi bakteerilaji pystytään tunnistamaan lajilleen taksonomisten markkerigeenien avulla. Myös uusien bakteeriryhmien ja lajien löytäminen tehostuu ja nopeutuu DNA-määrityksillä, sillä mahdollisesti vain,1-,3 maailman bakteereista pystytään kasvattamaan nykyisillä viljelytekniikoilla ja ravintoalustoilla (Amann et al. 199). Lääketieteessä on jo käytössä bakteerien tunnistusmenetelmiä, jotka pohjautuvat PCR ja DNA-siru tekniikkaan. Niiden avulla yksittäiset bakteerilajit voidaan tunnistaa nopeasti ja tarkasti. Teollisuusprosesseihin ja ympäristötutkimukseen liittyvässä mikrobiologiassa kokonaiskuvan saaminen bakteeripopulaatiosta näyttelee merkittävää osaa. Varsinaisten bakteerilajien tunnistaminen vaatii kuitenkin 16S markkerigeenin emäsjärjestyksen selvittämisen. Tämä DNA:n sekvensointi on työvaiheena moniosainen ja hidas toteuttaa. Tässä raportissa käsitellään LH-PCR menetelmän kautta saatua aineistoa, joka antaa viitteitä bakteeriryhmien suhteellisista muutoksista ajan ja näytteenottopaikan suhteen. Sekvensointia ja löydettyjen 16S geenien vertailua kansainvälisiin DNA sekvenssitietokantoihin tullaan jatkamaan lähikuukausien kuluessa niin, että lopulliset tulokset voidaan muokata teknistieteelliseen julkaisusarjaan lähetettäväksi käsikirjoitukseksi. 2

2 Tutkimuskohteet ja näytteiden otto Tutkimuksessa olivat mukana Tavase Oy:n ja Turun Seudun Vesi Oy:n suunnitellut imeytysalueet Pälkäneen Syrjänharjulla ja Alastaron Virttaankankaalla. Tutkimus suoritettiin kevään 28 aikana. Suunniteltujen imeytysalueiden pohjavesiputkiin (4 kpl) asennettiin biofilmikeräimet, jotka koostuivat useista liuskoista, jotka oli valmistettu polyeteenistä (Taulukot 1 ja 2). Virttaankankaalla biofilmikeräin asennettiin lisäksi kaivoon K41, joka sijaitsi putken VI46 vieressä. Vesi- ja biofilminäytteiden otto suoritettiin siten, että ennen pumppauksen aloittamista biofilmikeräin nostettiin pois putkesta, jonka jälkeen vettä pumpattiin n. 2 min ajan (~8 l/min) edustavan vesinäytteen saamiseksi akviferista. Lisäksi verrattiin häiriintymättömän pohjavesiputken veden (ennen pumppausta) ja pumpatun veden solumääriä. Biofilmikeräimistä otettiin kunakin kertana kolme (3) liuskaa, joille muodostuneen biofilmin kertymäaika määrittyi näytteenottoajankohdan mukaan. Pumppausten jälkeen biofilmikeräin laskettiin takaisin putkeen. Taulukko 1. Tutkimuksessa mukana olleet Syrjänhajun pohjavesiputket. Syrjänharju Pohjavesiputken kokonaispituus [m] 12 (tulevan imeytyskentän ja kaivon puolivälissä) 41 19 (lähellä imeytyskenttää, ampumaradan läheisyydessä) 3, 123 (Kaivoalueella) 43 129 (Lähellä imeytyskenttää) 39 Liuskojen asennussyvyys putken päästä [m] 37 27 26 36 Taulukko 2. Tutkimuksessa mukana olleet Virttaankankaan pohjavesiputket. Pohjavesiputken kokonaispituus [m] VI2 (tulevan imeytyskentän ja kaivon puolivälissä) VI46 (kaivon vieressä, vertailumahdollisuus) VI469 (kontrolliputki, imeytysalueen ulkopuolella) VK72 (kokoojaputki) 3 Analyysit 3.1 Kemialliset analyysit 41 39 96 Liuskojen asennussyvyys putken päästä [m] 2 2 47 1 ja 4 Vesinäytteiden lämpötila, ph ja happipitoisuus mitattiin kentällä kunkin näytteenoton yhteydessä (senionhq2, Hyxo Ltd). Syrjänharjun kemialliset vesianalyysit suoritettiin Kokemäenjoen vesistön vesiensuojeluyhdistys ry:n ja Virttaankankaan analyysit Lounais-Suomen vesi- ja ympäristötutkimus Oy:n laboratorioissa. Analyysit sisälsivät orgaanisen hiilen (TOC), typen eri muotojen (Kok-N, NO 2 +NO 3, NH 4 -N), kokonaisfosforin (Kok-P) ja liuenneen raudan (Fe) määritykset. 3.2 Kokonaissolumäärät Vesi- ja biofilminäytteiden kokonaissolumäärät määritettiin DAPI-värjäyksellä (4,6-diamidino-2- phenylindole, Molecular Probes) 24 h kuluessa näytteenotosta. Vesinäytteitä suodatettiin -2 ml,2 µm huokoskoon suodattimen (Nucleopore Polycarbonate Track-Etch Membrane, Whatman) läpi DAPI-värjäystä varten. Biofilmikeräimien solumäärä ja solujen alueellinen jakautuminen liuskalla määritettiin suoraan liuskan pinnalta DAPI-värjäyksellä. Suodattimien ja liuskojen solumäärät laskettiin epifluoresenssimikroskoopilla vesinäytteistä 2 ja biofilmiliuskoilta 4 kentältä. Vesinäytteiden osalta käytettiin rinnakkaisia näytteitä. 3

3.3 DNA:n uutto Vesinäytteet ja biofilmiliuskat käsiteltiin 3-72 tunnin kuluessa näytteiden otosta. Näytteiden säilytys tapahtui + 8 C lämpötilassa. Bakteerisolut kerättiin vesinäytteistä suodattamalla bakteerit,2 µm huokoskoon polykarbonaattisuodattimelle (Whatman). Suodatukseen käytetty vesitilavuus oli n. 2 litraa/näyte. Biofilmi irrotettiin PE-liuskoista, SDS-puskuriin sonikoimalla (3 x 1 min pulssit) sekä voimakkaalla ravistelulla (Vortex-laite). Biofilmi sentrifugoitiin putken pohjaan (3 min, x g) ja SDS-liuos poistettiin sakan päältä pipetoimalla varovasti. DNA uutto tehtiin vesinäytteen suodatinkalvolta ja biofilmisakasta Poversoil DNA isolation Kit-eristysreagensseilla (PowerSoil DNA kit, Mobio Laboratories). 3.4 LH-PCR Näytteissä olleiden bakteerien DNA monistettiin PCR reaktiolla ( µl kokonaistilavuus), jossa käytettiin seuraavia reagensseja ja määriä: 4,9 µl autoklavoitu (nanopure) vesi,, µl entsyymi-puskuri (DyNAzyme, 1x), 1. µl 1 mm dntp seos (Finnzymes),,8 µl -aluke (1 M, TAG Copenhagen A/S),,8 µl 3 -aluke (1 M, TAG Copenhagen A/S), 1. µl DNA (templaatti),, µl DyNAzyme II DNA polymeraasi-entsyymi (Finnzymes). LH-PCR 16S alukkeina käytettiin 27f 19r alukeparia: ( ) forward-aluke: AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG ( -pää IRD-7 leimattu) ja (3 ) reverse-aluke: ATT ACC GCG GCT GCT GG. PCR ohjelma koostui seuraavasti: 1. alkudenaturaatio: 9 ºC min, 2. denaturaatio: 94 ºC 1 min, 3. hybridisaatio: ºC 1 min, 4. ekstensio: 72 ºC sek, vaiheet: 2-4, 27 sykliä,. loppuekstensio: 72 ºC 1 min. Näytteiden monistuminen n. emäsalueelle tarkistettiin 1 EtBr-agaroosigeelissä: 8 µl näyte DNA:ta + 1,3 µl LB (6 x loading buffer). Monistukseen käytetyt alukkeet oli leimattu fosforamidiitilla (IRD 7 nm), jolloin vyöhykkeiden fluoresenssi saatiin terävästi näkyviin lasereksitaatiolla. Ajolaitteistona käytettiin geelisekvensointilaitetta (Li-Cor 42L-2), jolla ajautuvat DNA-nauhat luettiin emission taltioivan detektorin avulla digitaalikuvaksi. Tuloksena saatiin spesifinen 16S nauhojen ajautumisprofiili, josta voidaan määrittää kunkin sekvenssin suhteellinen intensiteetti. Kyseessä on ohjelmallinen densitometrinen määritys, jossa totaali-intensiteetti on vyöhykkeen kaikkien pikselien intensiteettien summa. Vyöhykkeiden emäspituus määritettiin näytteiden rinnalla ajettavien pituusstandardien (47, 489, 27, 3 ) avulla. Analyysiohjelmana käytettiin Bio-Radin Quantity One (versio: 4.1.) ohjelmaa ja band analysistoimintoa, jonka avulla määritettiin näytevyöhykkeiden pituudet ja intensiteetit. Kaikkien näyteerien tulokset taulukoitiin ohjelmassa niin, että saatiin pohjavesiputkien LH-PCR profiilit ja ns. kertymäprofiilit. 4

4 Tulokset 4.1 Pohjavesien kemiallinen koostumus Syrjänharjun ja Virttaankankaan pohjavesien kentällä mitatuissa parametreissa esiintyi suhteellisen vähän putkikohtaista vaihtelua tutkimusjakson aikana (Taulukot 3 ja 4). Myöskään alueen sisällä ei suuria eroja ollut. Syrjänharjun kaikkien pohjavesiputkien keskiarvot ja keskihajonta olivat: ph 6.4±.3, T 6.8±.8 C, konduktiivisuus 233±98 µs/m ja liuennut happi 9.6±1.2 mg/l. Virttaankankaan arvot olivat vastaavasti: ph 7.3±.7, T 6.1±.3 C, konduktiivisuus 77±14 µs/m ja liuennut happi 9.9±. mg/l. Suurin ero pohjavesialueiden välillä oli konduktiivisuudessa, mikä todennäköisesti johtuu Virttaankankaan pohjaveden vanhemmasta iästä eli pohjvasi on ollut kauemmin kosketuksissa akviferin mineraalipintojen kanssa. Lisäksi Virttaankankaan pohjaveden ph oli korkeampi. Taulukko 3. Pälkäneen Syrjänharjun kentällä näyteasemilta 12, 19, 123 ja 129 mitatut parametrit. 12 ph T Kond. DO DO Pvm [ C] [µs/m] [mg/l] [] 14.2.28 6.6 6.6 319 12.3.28 8.2 328 9. 1.4.28.9 7.3 32 9. 82.3 KA 6.3 7.4 324 9. Hajonta..8. 19 ph T Kond. DO DO Pvm [ C] [µs/m] [mg/l] [] 14.2.28 7. 88 12.3.28 6.9 9 11.2 1.4.28 6.3 6.8 89 11. 92. KA 6.7 6.4 89 11.1 Hajonta..8 1.1 123 ph T Kond. DO DO Pvm [ C] [µs/m] [mg/l] [] 14.2.28 6.4 6 24 12.3.28 7.2 213 8.1 1.4.28 6.1 6.8 213 7.8 7 KA 6.3 6.7 21 8. Hajonta.2.6.2.2 129 ph T Kond. DO DO Pvm [ C] [µs/m] [mg/l] [] 14.2.28 6.4 6.1 31 12.3.28 7.8 313 9. 1.4.28 6.2 6.8 3 1. 8. KA 6.3 6.9 38 9.8 Hajonta.1.9 7.4

Taulukko 4. Virttaankankaan kentällä näyteasemilta VI2, VI46, VI469 ja VK72 mitatut parametrit. VI2 ph T Kond. DO DO Pvm [ C] [µs/m] [mg/l] [] 3.1.28 8.2 6.2 98 31.1.28 6.8 6. 9 29.2.28 6.6 6.4 92 1. 8.4.28 6.9 6.8 8 1. 8. KA 7.1 6.4 93 1. Hajonta.7.3 6. VI46 ph T Kond. DO DO Pvm [ C] [µs/m] [mg/l] [] 3.1.28 8. 6. 78 31.1.28 7..8 7 29.2.28 7.3 6. 7 1.6 8.4.28 6.8 6. 8 1.3 8. KA 7.3 6. 77 1. Hajonta..1 3.2 VI469 ph T Kond. DO Pvm [ C] [µs/m] [mg/l] 3.1.28 9.2 6.2 7 31.1.28 7.4 6.1 49 29.2.28 8.2.7 8 9.1 8.4.28 6.9 6.4 8 9.7 KA 7.9 6.1 61 9.4 Hajonta 1..3 13.4 VK72 ph T Kond. DO Pvm [ C] [µs/m] [mg/l] 3.1.28 6.8.8 77 31.1.28 7.. 66 29.2.28 6.7.8 8 9.4 8.4.28 6.8 6.3 8 9.8 KA 7..9 76 9.6 Hajonta.4.3 7.3 Laboratoriossa suoritettujen analyysien tulokset on esitetty taulukoissa ja 6. Kaikkien vesinäytteiden TOC-pitoisuudet olivat hyvin alhaisia; yhtä lukuun ottamatta alle määritysrajan (<1, mg/l). Kokonaisfosforin pitoisuudet olivat samaa suuruusluokkaa molemmilla pohjavesialueilla. Kokonaistypen ja epäorgaanisen typen pitoisuudet puolestaan olivat jonkin verran korkeammat Syrjänharjulla. Liuenneen raudan pitoisuus oli Virttaankankaan pohjavedessä korkeampi ja Virtaankankaalla esiintyi jonkin verran vaihtelua (< 67 µg/l). Taulukko. Syrjänhajun pohjaveden kemiallinen koostumus (12.3.28). Putki TOC [mg/l] Kok-P [µg/l] Kok-N [mg/l] NO 2 +NO 3 [mg/l] NH 4 -N [mg/l] Liuennut Fe [µg/l] 12 1,1 1 8,8 9,4 <,7 <2 19 <1, 13 1,32 1,3 <,7 <2 123 <1, < 4,76,2 <,7 <2 129 <1, 17 1, 14, <,7 <2 6

Taulukko 6. Virttaankankaan pohjaveden kemiallinen koostumus (8.4.28). Putki TOC [mg/l] Kok-P [µg/l] Kok-N [mg/l] NO 2 +NO 3 [mg/l] NH 4 -N [mg/l] Liuennut Fe [µg/l] Kok-Fe [µg/l] VI2 <1, 1,2,71 <,3 11 VI469 <1, 2 <,,19 <,3 < VI6 <1, 14,9,67 <,3 6 VK72 <1, 36,98,12,6 4 67 4.2 Vesi- ja biofilminäytteiden solumäärät Vesinäytteiden osalta solumäärät laskettiin sekä pohjavesiputkista että pumpatusta pohjavedestä. Varsinkin pumpatun veden osalta solulaskentaa vaikeutti kiintoainepartikkeleiden suuri määrä sekä solujen pieni koko. Tulokset osoittivat solumäärien vaihtelevan sekä paikallisesti että ajallisesti (Kuvat 1 ja 2). Syrjänharjun näytteissä (12.3.28) putken vedessä oli enemmän soluja kuin pumpatussa vedessä, Virttaankankaalla osuudet vaihtelivat eri putkien välillä (8.4.28). Kaikkien näytteiden keskiarvot olivat Syrjänharjulla 2,8±1,1 1 solua/ml ja Virttaankankaalla 3,4±2,7 1 solua/ml. Tämä vastaa hyvin edellisissä tutkimuksissa pohjavesistä löydettyjä solumääriä. x 1 [solua ml -1 ] 9 8 7 6 4 3 2 Syrjänharju 1428 pumpattu vesi 1238 putken vesi 1238 pumpattu vesi 148 putken vesi 1 12 19 123 129 Havaintoputki Kuva 1. Syrjänharjun pohjavesinäytteiden solumäärät. 6 2928 pumpattu vesi 848 putken vesi 848 pumpattu vesi x 1 [solua /ml] 4 3 2 1 VI2 VI46 VI469 VK72 Havaintoputki Kuva 2. Virttaankankaan pohjavesinäytteiden solumäärät. 7

Syrjänharjulla ja Virttaankankaalla tarkkailuputkien biofilmikeräimiin kertyneiden bakteerisolujen lukumäärät laskettiin suoraan DAPI-värjätyistä PE-liuskoista n. kuukauden, kahden kuukauden ja kolmen kuukauden kertymäajan jälkeen (kuvat 3 ja 4). Biofilminäytteet edustivat koskematonta in situ biofilmiä. Pälkäneen Syrjänharjulla bakteeritiheyksien keskiarvo kaikista lasketuista liuskoista oli 1,3±1,8 1 6 solua/cm 2 ja Virttaankankaalla vastaavasti,6±3,72 1 solua/cm 2. Bakteerien solutiheys Syrjänharjun näytteissä vastaa talousvesiverkostoissa tavanomaisia biofilmitiheyksiä, Virtaankankaalla keskimääräinen solutiheys on alhaisempi. Biofilmien dynaaminen luonne näkyy molemmilla alueilla. Biofilmejä kertyy ja kasvaa pohjavesissä kaiken aikaa, mutta ne myös irtoavat ja hajoavat jatkuvasti. Tässä suhteessa pohjaveden ja talousveden biofilmien aikasarjat muistuttavat toisiaan: bakteerisolujen tiheys ei kasva systemaattisesti, eikä soluluku pysy vakiotasolla. Pälkäne 28 bakteerisoluja/cm2 4,E+6 3,E+6 3,E+6 2,E+6 2,E+6 1,E+6 1,E+6,E+,E+ 43d 7d 99d 12 19 123 129 Putki no Kuva 3. Syrjänharjun biofilmiliuskojen bakteerisolujen määrät. bakteerisoluja/cm2 2,E+6 1,E+6 1,E+6,E+,E+,E+,E+,E+,E+ Virttaankankaa TSV putket 8 28 29d 8d 97d 29d 8d 97d 72ylä 72ala 469 46 2 72ylä 72ala 469 46 2 2 46 putki 469 no 72ylä 72ala putki no putki no Kuva 4. Virttaankankaan biofilmiliuskojen bakteerisolujen määrät. 8

4.3 Mikrobiyhteisöt Pälkäneen ja Virttaankankaan pohjavesi (PV)- ja biofilminäytteiden (BF) mikrobiyhteisöjen LH- PCR-profiilit on esitetty kuvissa -13. Kussakin kuvassa on tietyn havaintoputken vesi- ja biofilmiprofiili vierekkäin tietyltä ajankohdalta ( 4 ja Pälkäne 3 kertaa). Kuvaajien x- akselilla on monistetun DNA-fragmentin pituus emäspareina ( =base pair). Kukin pituus kuvaa tiettyä bakteeriryhmää (esim. pituus on aktinobakteeriryhmä). Kuvaajien y-akselilla on puolestaan kunkin DNA-fragmentin eli bakteeriryhmän suhteellinen osuus näytteen kaikista bakteeriryhmistä. Vastaavat kuvaajat sekä kertymä- ja totaaliprofiilit on esitetty Liitteessä 1 kromatogrammeina. 4.3.1 Pälkäneen Syrjänharju Pälkäneen Syrjänharjun vesi -ja biofilminäytteiden bakteeriryhmien lukumäärät vaihtelivat välillä 16± ja 1±4, vastaavasti (Kuvat 1-8). Vesinäytteissä oli siis keskimäärin enemmän bakteeriryhmiä kuin biofilminäytteissä. Useimmissa näytteissä oli yhdestä muutamaan dominoiva bakteeriryhmä. Tämä kuitenkin vaihteli eri näytteiden osalta. Pohjavesien bakteeriryhmät Biofilmien bakteeriryhmät Pälkäne 14.2.8 putki: 12 PV Pälkäne 14.2.8 12 BF 14 12 1 8 6 4 2 46 47 48 49 1 2 3 4 6 6 4 3 2 1 46 47 48 49 1 2 3 4 6 Pälkäne 12.3.8 putki: 12 PV 3 3 2 2 1 1 46 47 48 49 1 2 3 4 6 3 2 2 1 1 Pälkäne 12.3.8 12 BF 46 47 48 49 1 2 3 4 6 3 2 2 1 1 Pälkäne 1.4.8 putki: 12 PV 46 47 48 49 1 2 3 4 6 Pälkäne 1.4.8 12 BF 4 3 3 2 2 1 1 46 47 48 49 1 2 3 4 6 Kuva. Pälkäneen Syrjänharjun putken 12 vesi -ja biofilminäytteiden bakteeriryhmäprofiilit. 9

Pohjavesien bakteeriryhmät Biofilmien bakteeriryhmät Pälkäne 14.2.8 putki: 19 PV 3 3 2 2 1 1 46 47 48 49 1 2 3 4 6 3 3 2 2 1 1 Pälkäne 14.2.8 19 BF 46 47 48 49 1 2 3 4 6 Pälkäne 12.3.8 putki: 19 PV 4 3 3 2 2 1 1 46 47 48 49 1 2 3 4 6 3 2 2 1 1 Pälkäne 12.3.8 19 BF 46 47 48 49 1 2 3 4 6 Pälkäne 1.4.8 putki: 19 PV Pälkäne 1.4.8 19 BF 3 2 2 1 1 46 47 48 49 1 2 3 4 6 6 4 3 2 1 46 47 48 49 1 2 3 4 6 Kuva 6. Pälkäneen Syrjänharjun putken 19 vesi -ja biofilminäytteiden bakteeriryhmäprofiilit. 1

Pohjavesien bakteeriryhmät Biofilmien bakteeriryhmät Pälkäne 14.2.8 putki: 123 PV Pälkäne 14.2.8 123 BF 3 2 2 1 1 46 47 48 49 1 2 3 4 6 4 3 3 2 2 1 1 46 47 48 49 1 2 3 4 6 Pälkäne 12.3.8 putki: 123 PV Pälkäne 12.3.8 123 BF 2 2 1 1 46 47 48 49 1 2 3 4 6 3 3 2 2 1 1 46 47 48 49 1 2 3 4 6 Pälkäne 1.4.8 putki: 123 PV Pälkäne 1.4.8 123 BF 4 3 3 2 2 1 1 46 47 48 49 1 2 3 4 6 3 2 2 1 1 46 47 48 49 1 2 3 4 6 Kuva 7. Pälkäneen Syrjänharjun putken 123 vesi -ja biofilminäytteiden bakteeriryhmäprofiilit. 11

Pohjavesien bakteeriryhmät Biofilmien bakteeriryhmät Pälkäne 14.2.8 putki: 129 PV Pälkäne 14.2.8 129 BF 3 3 2 2 1 1 46 47 48 49 1 2 3 4 6 4 3 2 1 46 47 48 49 1 2 3 4 6 Pälkäne 12.3.8 putki: 129 PV Pälkäne 12.3.8 129 BF 12 1 8 6 4 2 46 47 48 49 1 2 3 4 6 3 3 2 2 1 1 46 47 48 49 1 2 3 4 6 Pälkäne 1.4.8 putki: 129 PV Pälkäne 1.4.8 129 BF 4 3 2 1 46 47 48 49 1 2 3 4 6 3 2 2 1 1 46 47 48 49 1 2 3 4 6 Kuva 8. Pälkäneen Syrjänharjun putken 129 vesi -ja biofilminäytteiden bakteeriryhmäprofiilit. 12

4.3.2 Virttaankankaan vesi -ja biofilminäytteiden bakteeriryhmien lukumäärät vaihtelivat välillä 12±6 ja 9±3, vastaavasti (Kuvat 9-13). Kuten Syrjänharjulla, myös Virttaankankaan vesinäytteissä oli keskimäärin enemmän bakteeriryhmiä kuin vesinäytteissä ja vesi- ja biofilminäytteiden bakteeriryhmät poikkesivat selvästi toisistaan. Useimmissa näytteissä oli yhdestä muutamaan dominoiva bakteeriryhmä, joka vaihteli eri näytteiden osalta. Putken 72 kahden eri syvyydellä olleen biofilmin bakteeriryhmäprofiilit olivat melko samanlaisia. Kaivon K41 (kuvissa merkintä K4) biofilmissä oli bakteeriryhmiä vain 4 6 kpl, joista moni esiintyi myös kaivon vieressä olleen putken VI46 vesi- ja biofilminäytteessä. Pohjavesien bakteeriryhmät Biofilmien bakteeriryhmät 3.1.8 putki: 2 PV 3 2 2 1 1 46 47 48 49 1 2 3 4 6 31.1.8 putki: 2 PV 3 2 2 1 1 46 47 48 49 1 2 3 4 6 3 3 2 2 1 1 31.1.8 2 BF 46 47 48 49 1 2 3 4 6 4 3 2 1 29.2.8 putki: 2 PV 46 47 48 49 1 2 3 4 6 2 2 1 1 29.2.8 2 BF 46 47 48 49 1 2 3 4 6 8.4.8 putki: 2 PV 3 2 2 1 1 46 47 48 49 1 2 3 4 6 3 2 2 1 1 8.4.8 2 BF 46 47 48 49 1 2 3 4 6 Kuva 9. Virttaankankaan putken 2 vesi -ja biofilminäytteiden bakteeriryhmäprofiilit. 13

Pohjavesien bakteeriryhmät Biofilmien bakteeriryhmät 3.1.8 putki: 46 PV 3 2 2 1 1 46 47 48 49 1 2 3 4 6 4 3 2 1 31.1.8 putki: 46 PV 46 47 48 49 1 2 3 4 6 2 1 1 31.1.8 46 BF 46 47 48 49 1 2 3 4 6 2 1 1 29.2.8 putki: 46 PV 46 47 48 49 1 2 3 4 6 2 2 1 1 29.2.8 46 BF 46 47 48 49 1 2 3 4 6 8.4.8 putki: 46 PV 8.4.8 46 BF 3 2 2 1 1 46 47 48 49 1 2 3 4 6 7 6 4 3 2 1 46 47 48 49 1 2 3 4 6 Kuva 1. Virttaankankaan putken 46 vesi -ja biofilminäytteiden bakteeriryhmäprofiilit. 14

Pohjavesien bakteeriryhmät Biofilmien bakteeriryhmät 3.1.8 putki: 469 PV 4 3 2 1 46 47 48 49 1 2 3 4 6 8 6 4 2 31.1.8 putki: 469 PV 46 47 48 49 1 2 3 4 6 4 3 2 1 31.1.8 469 BF 46 47 48 49 1 2 3 4 6 29.2.8 putki: 469 PV 12 1 8 6 4 2 46 47 48 49 1 2 3 4 6 3 2 2 1 1 29.2.8 469 BF 46 47 48 49 1 2 3 4 6 2 2 1 1 8.4.8 putki: 469 PV 46 47 48 49 1 2 3 4 6 6 4 3 2 1 8.4.8 469 BF 46 47 48 49 1 2 3 4 6 Kuva 11. Virttaankankaan putken 469 vesi -ja biofilminäytteiden bakteeriryhmäprofiilit. 1

Pohjavesien bakteeriryhmät Biofilmien bakteeriryhmät 3.1.8 putki: 72 PV 4 3 2 1 46 47 48 49 1 2 3 4 6 31.1.8 putki: 72 PV 31.1.8 72 ylä BF 6 4 3 2 1 46 47 48 49 1 2 3 4 6 6 4 3 2 1 46 47 48 49 1 2 3 4 6 31.1.8 72 ala BF 4 3 2 1 46 47 48 49 1 2 3 4 6 2 2 1 1 29.2.8 putki: 72 PV 46 47 48 49 1 2 3 4 6 7 6 4 3 2 1 29.2.8 72 ylä BF 46 47 48 49 1 2 3 4 6 29.2.8 72 ala BF 2 2 1 1 46 47 48 49 1 2 3 4 6 16

8.4.8 putki: 72 PV 8.4.8 72 ylä BF 4 3 2 1 46 47 48 49 1 2 3 4 6 4 3 3 2 2 1 1 46 47 48 49 1 2 3 4 6 8.4.8 72 ala BF 4 3 2 1 46 47 48 49 1 2 3 4 6 Kuva 12. Virttaankankaan putken 72 vesi -ja biofilminäytteiden bakteeriryhmäprofiilit. Kaivon K41 vesi 31.1.8 K4 4 3 2 1 46 47 48 49 1 2 3 4 6 29.2.8 K4 2 2 1 1 46 47 48 49 1 2 3 4 6 8.4.8 K4 7 6 4 3 2 1 46 47 48 49 1 2 3 4 6 Kuva 13. Virttaankankaan kaivon K41 biofilminäytteen bakteeriryhmäprofiilit. 17

Tulosten tarkastelu Sekä Virttaankankaan että Syrjänharjun pohjavesien solumäärät vaihtelivat sekä ajallisesti että paikallisesti, keskiarvojen ollessa Syrjänharjulla 2,8±1,1 1 solua/ml ja ja Virttaankankaalla 3,4±2,7 1 solua/ml. Biofilmien osalta solumäärien keskiarvot Pälkäneellä olivat 1,3±1,8 1 6 solua/cm 2 ja Virttaankankaalla,6±3,72 1 solua/cm 2. Muissa vastaavissa tutkimuksissa pohjaveden solumäärien on todettu vaihtelevan välillä 1 3-1 7 solua/ml ja 1-1 8 solua/g sedimenttiä (Männistö et al. 21, Anderson and Lovley 1997, Hazen et al. 1991, Ghiorse and Wilson 1988). Sekä Virttaankankaan että Pälkäneen mikrobiyhteisöjen LH-PCR kuvaajista on nähtävissä voimakas vaihtelu eri näytteenottokertojen välillä muutamaa poikkeusta lukuunottamatta. Kuvaajien bakteeriryhmäpylväissä ei tapahdu asteittaisia muutoksia, vaan pylväiden sijainti ja - osuudet muuttuvat merkittävästi saman pohjavesiputken eri näyte-erissä. Vesi pääsee suhteellisen vapaasti liikkumaan pohjavesiputkien siivilärakenteissa eivätkä pohjavesivirtauksen ja sadeveden mukana liikkuvat bakteerit ole sidottuja tietylle rajapinnalle tai syvyysalueelle. Biofilmimuodostuksessa on myös nähtävissä voimakas bakteeriryhmävaihtelu neljän näytteenottokerran aikana. Biofilmin muodostuminen liuskalle on todennäköisesti hyvin sattumanvaraista eikä tietty bakteeriryhmä aina edusta samaa -osuutta. Bakteereja ravinnoksi käyttävät yksisoluiset alkueläimet saattavat myös hetkessä muuttaa bakteerien lajiryhmämääriä liuskoissa. Pälkäneen pohjavesiputken 19 vesinäytteissä 14.2. ja 12.3. on nähtävissä selvimmin bakteeripopulaation poikkeava säilyminen suhteellisen samankaltaisena. Kuukauden aikana lajiryhmät ja niiden suhteelliset määrät ovat muuttuneet vain vähän ja hallitseva 22 alueen ryhmä on säilyttänyt osuutensa lähes samankaltaisena. Mielenkiintoista on kuitenkin havaita Virttaankankaan pohjavesi- ja biofilminäytteiden kertymäprofiilien muistuttuvan huomattavasti toisiaan (Liitteen 1 kuvat L1-L4). Bakteeriryhmät keskittyvät 16S geenisekvenssin samoille pituusalueille ja bakteeriryhmien suhteellinen osuus (piikkien korkeus) toisiinsa nähden on profiileissa samansuuntainen. Eräissä tutkimuksissa on havaittu saman ekosysteemin vapaana uivan bakteeribiotan ja biofilmiä muodostavien bakteerien eroavan huomattavasti toisistaan (Kolehmainen et al. 28, Lahtinen et al. 26). Virttaankankaan pohjavesiputkeen 72 eri syvyyksille sijoitetut kaksi biofilmiliuskaa antavat kertymäkuvaajina hyvin samankaltaisen LH-PCR profiilin (Kuva L4). Liuskojen välinen etäisyys toisistaan oli n. 2 m. Tämä osoittaa biofilmimuodostajien olevan samaa lajistoa ainakin tällä etäisyysvälillä. Pituusalueilla 468 47 on nähtävissä voimakas kertymä molemmissa Virttaankankaan kokoomakuvaajissa ja tälle alueelle keskittyvät alfa-proteobakteerit. Se on tyypillinen ryhmä maaperänäytteissä, tosin osa tästä ryhmästä on aktiivinen vain maan orgaanisessa pintakerroksessa. Pituusalueelle 49 keskittyy hyvin paljon aktinobakteeri-luokan lajeja. Ne ovat Grampositiivisia bakteereita, joilla on korkea GC--suhde. Ne ovat tyypillisiä bakteereita maaperässä ja niillä on tärkeä tehtävä orgaanisen aineksen hajoituksessa ja hiilen kiertokulussa sekä humuksen muodostuksessa. Osa aktinobakteereista on potentiaalisia patogeeneja ja lisäksi niiden on arvioitu aiheuttavan veteen hajuja ja makuja. Pituusalueelta 19-22 on löydettävissä beta- ja gamma-proteobakteerien edustajia. Kyseisen alueen bakteeriryhmät ovat merkittävinä edustajina varsinkin Virttaankankaalla 29.2.8 otetuissa pohjavesi -ja biofilminäytteissä. Tämä näkyy varsinkin pohjavesiputkissa 46, 469 ja 72. 18

Kiinnostava havainto on pituusalueen 3 ilmaantuminen Virttaankankaan pohjavesi- ja biofilmiprofiileihin 8.4.8. Tämä on havaittavissa kaikissa pohjavesiputkien vesinäytteissä ja lähes kaikissa biofilminäytteissä. Alueelta löytyy mm. streptomycineae-ryhmän edustajia. Tulosten tarkastelu osoitti, että LH-PCR-kuvaajista löytyi useita toisiaan tukevia tuloksia, joten menetelmä soveltuu pohjaveden bakteeripopulaation seurantaan. LH-PCR-profiilit vaativat kuitenkin aina tuekseen 16S markkerigeenin emäsjärjestyksen selvittämisen eli DNA:n sekvensoinnin. Tulosmateriaalin käsittely, jonka saamme loppuun lähikuukausien kuluessa, tulee antamaan varmuuden nimetä dominoivat bakteeriryhmät ja siten tarkempaa tietoa planktonisista ja biofilmin muodostumiseen osallistuvista bakteereista. Tämä tulosiaineisto antaa näin ollen kuvan alueiden luonnontilaisista bakteeriyhteisöistä ja niiden vaihteluista. Tämän vuoden lopulla alkavassa Tekesin hankkeessa tullaan hyödyntämään tätä luonnontilaista lähtökohtaa, sillä se tulee olemaan nyt seurattavien mikrobiologisten tutkimusten referenssi. Lähdeluettelo Amann, R.I., Ludwig, W., Schleifer, K.H., 199. Phylogenetic identification and in situ detection of individual microbial cells without cultivation. Microbiol Rev 9: 143-169. Anderson, R.T., Lovley, D.R., 1997. Ecology and biochemistry of in situ groundwater bioremediation. Advances in Microbial Ecology 1:289-3. Ghiorse, W.C., Wilson, J.T., 1988. Microbial ecology of the terrestrial subsurface. Advances in Applied Microbiology 33:17-172. Hazen, T.C, Jimenéz, L., de Victoria, G.L., Fliermans, C.B., 1991. Comparison of bacteria from deep subsurface sediment and adjacent groundwater. Microbial Ecology 22:293-34. Kolehmainen R.E., Tiirola M., Puhakka J.A., 28. Spatial and temporal changes in Actinobacterial dominance in experimental artificial groundwater recharge. Water Research, submitted. Lahtinen, T., Kosonen, M., Tiirola, M., Vuento, M., Oker-Blom, C., 26. Diversity of bacteria contaminating paper machines. J Ind Microbiol Biotechnol 33: 734-74. Männistö, M.K., Salkinoja-Salonen, M.S., Puhakka, J.A., 21. In situ polychlorophenol bioremediation potential of the indigenous bacterial community of boreal groundwater. Water Research 3:2496-24. Suzuki, M., Rappe, M.S., Giovannoni, S.J., 1998. Kinetic bias in estimates of coastal picoplankton community structure obtained by measurements of small-subunit rrna gene PCR amplicon length heterogeneity. Appl Environ Microbiol 64: 422-429. Tiirola, M.A., Suvilampi, J.E., Kulomaa, M.S., Rintala JA., 23. Microbial diversity in a thermophilic aerobic biofilm process: analysis by length heterogeneity PCR (LH-PCR). Water Res 37: 229-2268 19

Liite 1. Syrjänharjun ja Virttaankankaan DNA-karakterisoinnin kertymä ja totaaliprofiilit. Kertymäprofiileihin on summattu kunkin pohjavesiputken kaikki kerätyt näytteet. Totaaliprofiileissa on esitetty kaikkien putkien tulokset samassa kuvaajassa. Pälkäne putki: 12 PV Pälkäne putki: 19 PV 4 3 2 1 46 47 48 49 1 2 3 4 6 8 7 6 4 3 2 1 46 47 48 49 1 2 3 4 6 Pälkäne putki: 123 PV Pälkäne putki: 129 PV 4 4 3 2 3 2 1 1 46 47 48 49 1 2 3 4 6 46 47 48 49 1 2 3 4 6 Pälkäne kaikki putket PV 14 12 1 8 6 4 2 46 47 48 49 1 2 3 4 6 Kuva L1. Pälkäneen Syrjänharjun pohjaveden (PV) LH-PCR kertymäprofiilit kunkin pohjavesiputken mikrobiyhteisöstä ja totaaliprofiili kaikista neljästä pohjavesiputkesta. 2

Pälkäne 12 BF Pälkäne 19 BF 7 6 4 3 2 1 46 47 48 49 1 2 3 4 6 9 8 7 6 4 3 2 1 46 47 48 49 1 2 3 4 6 Pälkäne 123 BF Pälkäne 129 BF 6 4 3 2 1 46 47 48 49 1 2 3 4 6 8 7 6 4 3 2 1 46 47 48 49 1 2 3 4 6 Pälkäne kaikki putket BF 2 1 1 46 47 48 49 1 2 3 4 6 Kuva L2. Pälkäneen Syrjänharjun biofilmin (BF) LH-PCR kertymäprofiilit kunkin pohjavesiputken mikrobiyhteisöstä ja totaaliprofiili kaikista neljästä pohjavesiputkesta. 21

4 3 2 1 putki: 2 PV 46 47 48 49 1 2 3 4 6 6 4 3 2 1 putki: 46 PV 46 47 48 49 1 2 3 4 6 7 6 4 3 2 1 putki: 469 PV 46 47 48 49 1 2 3 4 6 8 6 4 2 putki: 72 PV 46 47 48 49 1 2 3 4 6 kaikki putket PV 2 1 1 46 47 48 49 1 2 3 4 6 Kuva L3. Virttaankankaan pohjaveden (PV) LH-PCR kertymäprofiilit kunkin pohjavesiputken mikrobiyhteisöstä ja totaaliprofiili kaikista neljästä pohjavesiputkesta. 22

2 BF 46 BF 6 4 3 2 1 46 47 48 49 1 2 3 4 6 7 6 4 3 2 1 46 47 48 49 1 2 3 4 6 469 BF 72 ylä BF 6 4 3 2 1 46 47 48 49 1 2 3 4 6 7 6 4 3 2 1 46 47 48 49 1 2 3 4 6 4 3 2 1 72 ala BF 46 47 48 49 1 2 3 4 6 7 6 4 3 2 1 K4 46 47 48 49 1 2 3 4 6 kaikki putket BF 18 16 14 12 1 8 6 4 2 46 47 48 49 1 2 3 4 6 Kuva L4. Virttaankankaan biofilmin (BF) LH-PCR kertymäprofiilit kunkin pohjavesiputken mikrobiyhteisöstä ja totaaliprofiili kaikista neljästä pohjavesiputkesta. 23