KOHDERYHMÄ: Työ sopii parhaiten lukioon kursseille KE1 tai KE2. Työn voi tehdä myös yläkoululaisten kanssa kurssilla raaka-aineet ja tuotteet, jolloin keskitytään poolittomuuden sijaan erotusmenetelmiin. KESTO: noin 1h MOTIVAATIO: Kasvien värit ovat mielenkiintoisia ja lähellä oppilaan arkipäivää, työ on erittäin havainnollinen ja herättää pohtimaan erilaisten kasvien väriaineita. Samalla nähdään sovelluskohde erotusmenetelmän käytöstä. TAVOITE: Tavoitteena on oppia kromatografia erotusmenetelmänä ja käydä läpi poolisuutta. VINKKEJÄ: Työhön voi yhdistää molekyylimallinnusta. Tähän työhön on rakennettu myös animaatio, joka havainnollistaa luteiinin ja beta-karoteenin kulkeutumista tlc-levyn pinnalla, perustuen poolisuuden aiheuttamaan jarrutukseen. AVAINSANAT: Kromatografia Elinympäristö Poolisuus Arkipäivän kemia
TAUSTAA Värien monimuotoisuus on aina kiehtonut luonnontieteilijöitä, mutta vasta 1900-luvun alkupuolella alettiin ymmärtää pigmentteihin liittyvää kemiaa. Syynä tähän oli tarkoitukseen sopimattomat laboratoriovälineet ja menetelmät. Pigmentit esiintyvät luonnon materiaaleissa niin pieninä ainemäärinä, että niiden eristäminen oli vaikeaa ja vaikka eristäminen olisi onnistunut, puhtaita näytteitä ei kuitenkaan olisi pystytty analysoimaan käytössä olevilla menetelmillä riittävän tarkasti. Tarkkoihin määrityksiin olisi tarvittu paljon näytteitä. Vasta kromatografian kehittyminen antoi työkalut pigmenttien käsittelyyn laboratoriossa. Kasveissa on sekä rasva- että vesiliukoisia pigmenttejä. Rasvaliukoiset pigmentit ovat karotenoideja. Karotenoidit voidaan jakaa karoteeneihin ja ksantofylleihin. Karoteenit (kuva 1) ja ksantofyllit ovat molemmat rakenteeltaan samankaltaisia, isokokoisia isopreenihiilivetyjä, mutta ksantofyllien rakenteet sisältävät happea (kuva 2). Karoteenit ja ksantofyllit ovat pääosin keltaisia pigmenttejä, beta-karoteeni on oranssinkeltainen ja ksantofylli luteiini on keltainen, mutta ne ilmenevät usein kasveissa vihreänä värinä. Kuva 1. beta-karoteenin rakennekaava. Kuva 2. Luteiinin rakennekaava.
Värien eristys ohutkerroskromatografialla perustuu molekyylien polaarisuus eroon, jolloin ne liikkuvat levyllä eri nopeudella. Ohutkerroskromatografialevyssä on polaarista piihappogeeliä, jolloin polaariset molekyylit liikkuvat levyä pitkin hitaammin kuin poolittomat. Beta-karoteenin nousee levyllä korkeammalle kuin luteiini, koska luteiinissa olevat hydroksyyliryhmät tekevät siitä beta-karoteenia polaarisemman. ENNAKKOTEHTÄVIÄ Mistä ruska johtuu? Mitä väriaineita kasvien lehdissä on? Missä kasvien väriaineet sijaitsevat? TYÖTURVALLISUUS JA JÄTTEIDEN KÄSITTELY REAGENSSIT asetonia n-heksaania dietyylieetteriä Valitsemasi kasvin lehtiä Suojatakki, - lasit ja -hanskat! Työssä käytettävät reagenssit ovat haihtuvia ja herkästi syttyviä. Työ tehdään vetokaapissa. Asetoni ärsyttää silmiä ja heksaani ihoa. Dietyylieetteri ärsyttää molempia. Roiskeet silmistä ja iholta huuhdellaan runsaalla vedellä. Tarvittaessa lääkäriin! Heksaani on myrkyllinen vesieliöille. Käytetyt lehdet hävitetään biojätteisiin. Liuokset hävitetään orgaaniseen jätteeseen
TARVIKKET ohutkerroskromatografia levy ja ajoastia mittalasi 25 ml suodatin paperia suppilo huhmare ja survin petrimalja TYÖOHJE Työskentelyn aikana näytteet on suojattava valolta mahdollisimman hyvin karotenoidien hajoamisen estämiseksi. Punnitse noin 2 g kasvin lehtiä, silppua ne saksilla huhmareeseen ja hienonna (noin 10 20 min) 12 ml:ssa 100 % asetonia. Jos asetoni haihtuu hienonnuksen aikana, voit lisätä sitä hieman. Suodata homogenaatit petrimaljoille. Karotenoidit eristetään näytteestä ohutkerroskromatografian avulla. Ajoastioita + ajoliuosta valmistetaan kahdelle parille 1kpl, jota molemmat käyttävät, koska samassa ajoastiassa voi ajaa useampia liuskoja samanaikaisesti.
Valmista kromatografian ajoliuos sekoittamalla 3ml n-heksaania ja 7 ml dietyylieetteriä ajoastiaan. Anna ajoliuoksen kaasuuntua astiassa 5 minuuttia. Ohutlevykromatografia levyt saat opettajilta. Merkitse ajolevyn alareunaan pieni merkki 1cm ja yläreunaan viiva 0,5cm kohdalle pehmeällä lyijykynällä. Merkitse yläreunaan parin nimikirjaimet 0,5cm alueelle. Kasta levyn alapää näytteeseen ja anna imeytyä 1 cm verran, toista imeytys viisi kertaa. Suorita ajo ja anna liuotin rajan nousta noin 0,5 cm päähän levyn yläreunasta. Ajon jälkeen anna levyn kuivua hyvin. Piirrä ja merkitse vyöhykkeet. Liuotin ja ajoolosuhteet vaikuttavat karotenoidien erottuvuuteen. Liuottimesta ja kromatografiasta huolimatta karotenoidit asettuvat seuraavaan järjestykseen. beta-karoteeni (oranssi tai keltainen) feofytiini (harmaanvihreä) klorofylli a (sinivihreä tai oliivinvihreä) klorofylli b (harmaanvihreä tai kirkkaanvihreä) violaksantaani, neoksantaani ja kryproksantaani (keltainen) kseaksantaani (ruskean keltainen) luteiini (keltainen)