(B) (11) KUULUTUSJULKAISU UTLAGGNINGSSKRIFT 83667 _. (51) Kv.lk.5 - Int.cl.5 C 12N 5/18, A 61K 39/012 SUOMI-FINLAND (FI) Patentti- ja rekisterihallitus Patent- och registerstyrelsen (21) Patenttihakemus - Patentansökning 843142 (22) Hakemispäivä - Ansökningsdag 09.08.84 (24) Alkupäivä - Löpdag 09.08.84 (41) Tullut julkiseksi - Blivit offentlig 20.02.85 (44) Nähtäväksipanon ja kuul.julkaisun pvm. - Ansökan utlagd och utl.skriften publicerad 30.04.91 (32) (33) (31) Etuoikeus - Prioritet 19.08.83 US 524819 P (71) Hakija - Sökande 1. American Cyanamid Company, Wayne, N.J., USA, (US) (72) Keksijä - Uppfinnare 1. Schenkel, Robert Harris, 355 Robin Hood Drive, Yardley, Pa., USA, (US) 2. Wong, Rosie Bick-Har, 16 Ross Hall Boulevard, Piscataway, N.J., USA, (US) 3. Thammana, Pallaiah, 8 Village Green Way, Hazlet, N.J., USA, (US) (74) Asiamies - Ombud: Oy Kolster Ab (54) Keksinnön nimitys - Uppfinningens benämning Menetelmä monoklonaalisten vasta-aineiden valmistamiseksi Eimeria tenella:n itiöitä vastaan sekä menetelmä E. tenella-rokotteen valmistamiseksi Förfarande för framställning av monoklonala antikroppar mot sporozoiter av Eimeria tenella och förfarande för framställning av E. tenella-vaccin (56) Viitejulkaisut - Anförda publikationer (57) Tiivistelmä - Sammandrag Keksintö koskee Eimeria spp. itiöitä vastustavia mcnoklonaalisia vastaaineita, joita valmistetaan hybridoomatekniikalla. Keksintö koskee myös spesifisiä itiöantigeenejä käytettäväksi rokotteina kokkidioosin ennaltaehkäisyssä ja hoidossa ja monoklonaalisia vasta-aineita tuottavia hybridoomaviljelmiä. Uppfinningen hänför sig till monoklonala antikroppar mot sporozoiter av Eimeria spp. vilka antikroppar framställs genom hybridomateknik. Uppfinningen hänför sig även till specifika antigener för användning som vaccin vid förebyggande och behandling av coccidiosis och till hybridomakulturer, vilka producerar monoklonala antikroppar.
1 83667 Menetelmä monoklonaalisten vasta-aineiden valmistamiseksi Eimeria tenella:n itiöitä vastaan sekä menetelmä E. tenella-rokotteen valmistamiseksi 5 Tässä esitetty keksintö koskee menetelmää monokloo- nisten vasta-aineiden valmistamiseksi, jotka ovat erityisen aktiivisia parasiitti Eimeria tenella'n itiöitä vastaan. Esitetään hybridooma viljelmiä, jotka tuottavat vasta-aineita E.tenellaa vastaan. Kyseisiä vasta-aineita saa- 10 daan hybridoomatekniikalla. Itiö vasta-aineet todetaan ja tunnistetaan. Kyseiset antigeenit ja eräät määrätyt monoklooniset vasta-aineet ovat tehokkaita kokkidioosin ennaltaehkäisyssä ja hoidossa. Keksintö koskee myös menetelmää E. tenella-rokotteen valmistamiseksi. Vasta-aineet ovat 15 myös hyödyllisiä rokotteina kokkidioosia vastaan. Taustatietona mainittakoon, että kokkidioosi on eläimissä esiintyvät sairaus, jonka aiheuttaa joukko alkueläin parasiitteja. Linnuissa esiintyvä kokkidioosi on tuhoisa siipikarjan tauti, jonka aiheuttaa joukko suvun 20 Eimeria-lajeja. Kyseisellä taudilla on monimutkainen elinkierto, joka koostuu sekä suvuttomista että suvullisista vaiheista. Kanat saavat alunperin tartunnan tautiin nieltyään vapaana olevia munarakkuloita, joita yleensä esiintyy ulosteissa. Munarakkulat kehittyvät tauteja levittä- 25 viksi suvuttomiksi itiöiksi kanan ruuansulatuskanavassa. Itiöt tartuttavat epiteelisoluja ja kehittyvät monitumaisiksi rakenteiksi, jotka tunnetaan halkioina. Jokainen halkio kehittyy ja lopulta vapauttaa useita tauteja levittäviä suvuttomia rakenteita, jotka tunnetaan merotsoiit- 30 teina. Kyseiset merotsoiitit poistuvat tartunnan saaneista soluista ja tartuttavat muita epiteelisoluja. Itiöihin ja merotsoiitteihin liittyvät useat tauteja levittävät suvuttomat vaiheet muodostavat suurelta osin kokkidioosin patologian. Kokkidioosin suvullinen kierto 35 alkaa, kun merotsoiitit erottuvat gametosyyteiksi. Hedel-
2 83667 möityminen tapahtuu ja hedelmöitymistuotteet, jotka tunnetaan munarakkuloina vapautuvat ulosteisiin. Täten parasiitin elinkierto on päättynyt. Kanoissa Eimeria tenella'n elinkierto, joka on tyypillinen laji, on päättynyt noin 5 7:ssä 9:ssä päivässä. Johtuen valtavista taloudellisista tappioista, joita koituu siipikarjateollisuudelle Eimeria-lajien takia, on rokote parasiittia vastaan erittäin toivottava. Kuitenkin, johtuen parasiitin elinkierron monimutkaisuudesta ja 10 jokaisessa elinvaiheessa olevien useiden antigeenien lukumäärän vaihtelevuudesta, on huomattu, että deaktivoidut tai tapetut parasiitit eivät ole saaneet aikaan jatkuvaa immuniteettiä. Eräs ratkaisu kyseiseen ongelmaan on eristää ja tunnistaa tietyt antigeenit parasiitistä ja antaa 15 niitä riittävässä määrin jotta ne voivat toimia immunoivina aineina. Edullisesti kyseiset antigeenit suojaavat kaikkien tärkeitten lajien tartunnoilta. On tunnettua, että Eimeria'n useilla lajeilla, yhtä hyvin kuin saman lajin elinkierron eri vaiheilla on sekä yhteisiä että 20 spesifisiä antigeenejä (Cerna, Z., Folia Parasitologica (Praha) 17:135-140 (1970); Davis et al., Immunol. 34: 879-888 (1978); Rose, M.E., Immunol. 2:112122 (1959); Rose et al., Immunol. 5:79-92 (1962); ja Tanelian et al., Acta Parasitol. Yugosl. 7:79-84 (1976)). 25 On myös tunnettua, että immuniteetin kehittyminen Eimeriaa vastaan on lajikohtaista ja joissakin kotieläin lintulajeissa on huomattavaa kantakohtaista immuniteettia (Jeffers, T.K.; In Long, P.L. et al (eds), Avian Coccidiosis, pp. 57125, Proc. 13th Poultry Sci Symp (1978); Jou- 30 ner, L.P., Parasitol. 59:725-732 (1969); Long, P.L., Parasitol. 69:227-347 (1974); ja Long et al., Parasitol. 79: 451-457 (1979)). Tällä hetkellä Eimeria-lajin immunogeenejä, jotka voisivat synnyttää suojaavaa immuniteettiä linnuissa tai nisäkkäissä, ei vielä ole eristetty tai todet- 35 tu. Kyseisillä Eimeria immunogeeneillä todennäköisesti
3 83667 saadaan aikaan onnistunut immunisointi kokkidioosia vastaan. Lymfosyytti hybridoomatekniikan kehityksellä on saatu keino, jolla voidaan tuottaa suhteellisen suuria 5 määriä määrättyjä vasta-aineita lukuisia Eimeria'n anti- geenejä vastaan. Yhdistämällä määrätyt vasta-ainetta tuottavat (pernasolut) solut selkäydinkasvaimesta saaduilla soluilla, on mandollista valmistaa hybridoomasoluja, jotka erittävät monokloonisia vasta-aineita, jotka on eri- 10 tyisesti tarkoitettu alkuperäistä herkistävää antigeeniä vastaan. (Köhler & Milstein, Nature (Lontoo) 256:495-497 (1975). Jos parasiitin vastaisia vasta-aineita saadaan, voi olla mandollista siirtää kyseiset vasta-aineet tartunnan saaneeseen tai altistuneeseen siipikarjaan ja täten 15 aikaansaada isäntäorganismille määrätty passiivinen immuniteetti. Kun monoklonaalisia vasta-aineita tuottavia hybridoomaviljelmiä on saatu, on mandollista eri menetelmillä käyttää kyseisiä vasta-aineita eristämään ja toteamaan määrättyjä antigeenejä, joita puolestaan voitaisiin käyt- 20 tää rokotteina jotta isäntäorganismille saataisiin aktiivinen immuniteetti. Tunnetaan lukuisia hybridoomaviljelmiin ja monoklonaalisiin vasta-aineisiin liittyviä patenttijulkaisuja (se on US-pat.nrot 4 172 124; 4 196 265; 4 271 145; 4 361 549; 4 631 550; 4 364 932; 4 364 933; 4 364 25 934; 4 364 935; 4 364 936; 4 381 292 ja 4 381 295). Edellä olleen esityksen valossa kokkidioosin taloudellisista vaikutuksista karjanhoitoon ja erityisemmin siipikarjateollisuuteen, on Eimeria-alkueläin parasiitin hallinta hyvin toivottavaa. Yhtäpitävästi, keksinnön tar- 30 koituksena on saada aikaan uusia ja käyttökelpoisia monoklonaalisia vasta-aineita suvun Eimeria-itiöitä vastaan. Lisätarkoituksena on eristää ja todeta määrätyt E.tenella antigeenit, jotka ovat käyttökelpoisia rokotteina linnuissa esiintyvän kokkidioosin hallitsemiseksi. Kyseiset tar- 35 koitukset esitetään seuraavassa kuvauksessa ja keksinnön
4 83667 mukaisille menetelmille on tunnusomaista se, mitä patenttivaatimuksissa esitetään. E.tenella'n itiöiden valmistetta käytetään immunisoimaan hiiriä jotta lopuksi saataisiin monoklonaalisia 5 vasta-aineita Köhlerin ja Milsteinin menetelmällä kuten alla on esitetty. Monoklonaalisilla vasta-aineilla todetaan parasiitin antigeenejä. Antigeenit, jotka tuovat esiin monoklonaalisia vasta-aineita, jotka reagoivat itiöitten kanssa ja hillitsevät parasiitin kasvua, pidetään 10 suojaavina antigeeneinä. Eimeria'n useissa lajeissa esiintyviä suojaavia antigeenejä pidetään mandollisina ehdokkaina linnuissa esiintyvää kokkidioosia vastaan käytettävän rokotteen kehittämiseksi. Liukoisia antigeenejä saadaan E.tenella'n itiöistä. 15 Kyseiset liukoiset antigeenit erotetaan elektroforeettisesti molekyylipainon mukaan ja ne, jotka erityisesti reagoivat keksinnön mukaisesti valmisteltujen monoklonaalisten vasta-aineiden kanssa, todetaan. Käyttämällä sopivia standardeja, reaktiiviset antigeenit tunnistetaan molekyy- 20 lipainon perusteella. Jotta voitaisiin arvioida monoklonaalisten vastaaineiden kykyä tehokkaasti neutraloida kokkidioosi-itiöiden tartuttamiskykyä, asetetaan kanat alttiiksi E.tenella'n itiöille, joita on aiemmin käsitelty useilla keksin- 25 nön mukaisesti valmistetuilla monoklonaalisilla vasta-aineilla. Kyseinen elävässä elimistössä tapahtuva koesysteemi osoittaa valikoitujen monoklonaalisten vasta-aineiden suojaavia ominaisuuksia. Kanojen, jotka saivat liuenneiden itiöantigeenien 30 ruiskeita ja niitä, jotka oli todettu vastaavilla monoklonaalisilla vasta-aineilla, huomattiin olevan suojattuja suun kautta saatavaa tartuntaa vastaan. Kyseinen immunisointimenetelmä osoittaa mandollisuutta käyttää monoklonaalisilla vasta-aineilla tunnistettavia antigeenejä 35 rokotteina.
5 83667 Seuraavat esimerkit kuvaavat keksintöä tarkemmin. Esimerkki 1 Hybridoomasolulinjojen valmistus Eimeria tenella'n itiöitä saadaan tyhjentämällä 5 itiöityneet munarakkulat itiöistä tunnetuilla menetelmillä (Doran et al., Proc. Hemintol. Soc. Wash. 34:59-65 (1967)). Täten saatua E.tenella'n itiövalmistetta käytetään immunisoimaan kandeksantoista viikkoa vanhoja BALB/c hiiriä vatsakalvonsisäisillä ruiskeilla. Kun on määritet- 10 ty, että immunisoitu hiiri tuottaa itiöitä vastustavia vasta-aineita käyttämällä epäsuoraa immunofluorisenssianalyysi (IFA)-menetelmää, joka on tunnettu tekniikassa, saadaan pernasoluja hiiristä ja ne yhdistetään hiiren selkäydin solulinjan P3 x 63.Ag8.653 kanssa. Yhdistyminen suo- 15 ritetaan 30:sta 35 %:n polyetyleeniglykolin läsnäollessa (950-1050). Menetelmä hybridoomien tuottamiseksi on esitetty aikaisemmin (vrt. Kennett et al., Monoclonal antibodies-plenum press: 365-371, 1980). Hybridooma yhdistymistuotteita viljellään HAT-alustassa (Littlefield, J.W. 20 Sciense, 145:709-710 (1964)), jossa on Iscove'n modifioitua Dulbecco'n alustaa, johon on lisätty 20 % sikiövasikan seerumi lisäainetta. Elatusaineita valvotaan itiöitä tuhoavaa vasta-aine-tuotantoa varten epäsuoralla immunofluoresenssi-analyysillä (IFA) käyttäen glutaraldehydiin si- 25 dottuja E.tenella'n itiöitä antigeenilähteenä. Kaikista koeviljelmistä, 33 maljaa oli positiivisia IFA:lla analysoituna. Jotta varmistettiin hybridoomaviljelmien monoklonaalisuus, käytettiin rajoittavaa laimennusmenetelmää. Kun 30 E.tenella'n itiöt oli saatettu alttiiksi tuotetuille monille monoklonaalisille vasta-aineille, huomattiin käsitellyissä itiöissä kolme pää-ifa-reaktiivisuusmallia: 1) Itiöitten koko pinnalla tapahtuva reaktio; 2) paikoitellen itiöissä tapahtuva pintareaktio; 35 3) itiöitten tumakalvon ympärillä tapahtuva sisäinen reaktio.
6 83667 Kyseiset reaktiomallit vahvistettiin ferriitti-merkinnällä ja läpäisyelektronimikroskopialla (Speer et al., J. of Protozoology in press). Kuten IFA:lla oli määritetty, hybridoomaviljelmät tuottavat identtisiä vasta-aineita 5 kloonauksen jälkeen. Klooneja kasvatetaan joko elimistön ulkopuolella tai BALB/c hiirissä vatsakalvokasvaimina ja vasta-aineiden konsentraatio askiites-nesteessä on enimmiltään noin 10 mg/ml. Esimerkki 2 10 E.tenella'n itiöihin liittyvien antigeenien valmistus Juuri munarakkuloista tyhjennettyjä E.tenella'n itiöitä käytetään antigeenin valmistukseen. Itiöitten ulompien kalvojen osat uutetaan detergenteillä (se on 15 0,5 % Nonidet P40, 0,5-2 % CHAPA:a tai 0,5-1 % Triton X- 100) 5 mm:ssa natriumfosfaattipuskuriliuosta, jonka ph on 7,8. Puskuriliuos sisältää seuraavat proteaasi inhibiittorit: aprotiniinia (2 trypsiiniyksikköä/ml); antipainia (25 g/ml); leupeptiiniä (25 g/ml), fenyylimetyylisulfonyyli- 20 fluoridia (4 mm) (Yoshida et al., J. Exp, Med., 154:1225-1236 (1981)). Detergentillä liuotettu aine sentrifugoidaan 100 000 x g:ssa 10 minuutin ajan jotta kiintoaines saataisiin poistettua. Kirkkaassa sakan ylle nousseessa nesteessä on E.tenella'n itiöihin liittyviä liukoisia antigeene- 25 jä. Esimerkki 3 Antigeenin tunnistaminen E.tenella'n itiöiden liukoiset antigeenit erotetaan molekyylipainon mukaan käyttämällä SDS polyakryyliamidi- 30 geelielektroforeesia (PAGE) (Laemmii, UK, Nature 227:680-685)). SDS PAGE:lla erotetut proteiinit siirretään elektroforeettisesti nitroselluloosakalvoille käyttäen Western'in blottausmenetelmää (Towbin et al., Proc., Natl. Acad. Sci. (USA) 76: 4350-4354 (1979)). Nitroselluloosa- 35 suodatin saatetaan reagoimaan joko laimennetussa askiites-
7 83667 nesteessä tai käytetyssä hybridooma-viljelynesteessä, jossa on vasta-aineita. Sidotut monoklooniset vasta-aineet havaitaan käyttämällä radioimmuno-havaintomenetelmää, johon liittyy 125 I-merkittyanti-hiiri IgG vasta-aine (New 5 England Nuclear). Toinen vapaa vasta-aine poistetaan pesemällä ja nitroselluloosa suodattimet kuvataan Kodak röntgenfilmillä XAR-5. Vaihtoehtoisesti, määrätyt antigeeni-monokionaaliset vasta-aine-kompleksit todetaan ELISA-tekniikalla käyt- 10 täen piparjuuriperoksidaasia, johon on yhdistetty jänis IgG vasta-ainetta (Coppel Lab) hiiri-immunoglobuliinia vastaan (Burnette et al., Anal. Biochem. 112:195-203 (1981)). Käytetään BioRad immunoblottausanalyysijärjestelmää. 15 Reaktiivisten itiöantigeenien näennäiset molekyyli- painot määritetään vertaamalla antigeenien elektroforeettisia Rf-arvoja tunnetun molekyylipainon omaavien yhdisteiden Rf-arvojen kanssa, joita käytetään standardeina antigeenien kanssa samassa systeemissä. Eri antigeenien 20 kokeelliset mole kyyliarvot on esitetty taulukossa I. Taulukko I Eri E.tenella-itiöantigeenien molekyylipainomääritys Hydridooma- Monoklonaa- Antigeenin näennäismolekyyliviljelmä Linen vasta- paino 25 aine s5e5 sl 110 ± 16, 130 ± 20 kd s4e2 s2 110 ± 16, 130 ± 20 kd slc4 s3 66 ± 9 kd, 55 ± 8 kd, 30 15 ± 2 kd s2g8 s4 55 ± 8 kd s5b9 s5 55 ± 8 kd sla s6 54 ± 8 kd s3c11 s7 50 ± 7 kd 35 s3d3 s8 29 ± 4 kd 20-30 kd, 18 ± 3 kd, sle4 s9 58 ± 9 kd, 130 ± 20 kd
8 83667 Esimerkki 4 E.tenella'nitiöidenneutralointimonoklonaalisilla vasta-aineilla käyttäen kanan elävässä elimistössä tapahtuvaa koetta 5 Elävässä elimistössä olevaa systeemiä käytetään arvioimaan hybridoomasolulinjoilla valmistettujen monoklonaalisten vasta-aineiden kykyä neutraloida E.tenella'n itiöitä. Lintujen umpisuolet ovat alueita, joissa E.tenella'n tartunta tapahtuu ja niihin päästään käsiksi 10 kirurgisesti (Burns et al., Exp. Parasitol. 68:1117-1123 (1982)). Kanojen umpisuolet otetaan esille kirurgisesti ja käsitellään E.tenella'n itiöitten valmisteilla, jotka on aikaisemmin käsitelty valmistetuilla monoklonaalisilla vasta-aineilla. 15 Juuri munarakkuloista tyhjennettyjä itiöitä inkuboidaan steriileissä olosuhteissa lämpöinaktivoidulla askiitesnesteellä, jossa on monokloonisia vasta-aineita, jotka on johdettu hybridoomasolulinjoista. Inkubointiaika on 30:stä 60:een minuuttiin 25:stä 37 C:seen. 60 minuutin 20 inkubointiaika 37 C:ssa on edullinen. Käsitellyt itiöt saatetaan kolmen viikon vanhojen kanojen umpisuoliin kirurgisesti. Viisi päivää kestäneen infektioajan lopussa tartutettujen kanojen umpisuolia tarkkaillaan haavautumien havaitsemiseksi. Viisi päiväinen infektioaika on kokkidi- 25 oosin tuhoisin vaihe. Kokeen tulokset on esitetty taulukossa II. Huomataan, että monoklonaalisilla vasta-aineilla s3 ja s8 kummallakin saatiin 60 % kokonaissuojaus E.tenella'n itiöiden tartuntaa vastaan.
Taulukko II Elävässä elimistössä tapahtunut eri monoklonaalisten vasta-aineiden arvostelu E.tenellan itiöitten hallitsemiseksi Hoitohybridooma (monoklonaalisen vasta-aineen lähde) Monoklonaalisen vasta-aineen nro Itiöiden lukumäärä Suojaus % Ei yhtään Osittain Täysin 2000 70 21 9 s3d3 s8 2000 30 10 60 s2g8 s9 2000 100 0 0 slc4 s3 2000 20 20 60 sle4 s9 2000 60 0 40 s303 & s2g8 s8 + s4 2000 25 19 56 s3d3 & slc4 s8 + s3 2000 75 0 25 3000 89 11 0 s3d3 s8 3000 60 40 0 s2g8 s4 3000 67 16 16 slc4 s3 3000 50 0 50 sle4 s9 3000 100 0 0 s3d3 & s2g8 s8 + s4 4000 50 50 0 s3d3 & slc4 s8 + s3 3000 50 0 50 s3d3 & sla s8 + s6 3000 BO 0 20
10 83667 Esimerkki 5 Immunisointi E.tenellan itiöiden antigeeneillä Viikon vanhat kanat immunisoitiin vatsakalvonsisäisesti liuenneilla E.tenella'n itiöiden antigeeneillä. 5 Ensimmäisissä ruiskeissa oli proteiinipitoista ainetta, joka oli johdettu 1,5 x 107 itiöstä Freund'in täydellisessä lisäaineessa. Kaksi lisäruisketta seurasi kymmenen päivän välein ja kummassakin oli puolet alkuperäisestä immunoivasta annoksesta Freund'in epätäydellisessä lisäainees- 10 sa. Kymmenen päivää viimeisen ruiskeen jälkeen, kanoille annettiin 50 000 munarakkulaa suun kautta. Viisi päivää antamisen jälkeen havaittiin umpisuolissa haavautumia. Kokeen tulokset on esitetty taulukossa III. Huomataan, että liukoiset antigeenit suojaavat huomattavissa määrin 15 suun kautta annettuja munarakkuloita vastaan, kun taas tavalliset kanat eivät ole suojattuja. Taulukko III Hoito Suojausprosentti (% koelinnuista) 20 Ei yhtään Osittain Täysin Kontrolli 100 0 0 Immunoitu 0 33 66 Uudet monoklonaaliset vasta-aineet, nro slc4, nro 25 s3d3, nro sle4, nro s5b5, nro sla ja nro s2g8, jotka on eristetty kuten yllä on esitetty ovat talletettuina American Type Culture Collection'issa (ATCC), joka sijaitsee Rockvillessä, Marylandissa ja ne on lisätty sen pysyviin kokoelmiin. Nro:lle slc4 on annettu numero HB8333; nro:lle 30 s3d3 on annettu numero HB8331, nro:lle sle4 on annettu numero HB8332, nro:lle s5b9 on annettu numero HB8402, nro:lle s5e5 on annettu numero HB8403, nro:lle sla on annettu numero HB8404 ja nro:lle s2g8 on annettu numero HB8405. Vasta-aineisiin pääsee tutustumaan patenttihake- 35 muksen ollessa käsittelyssä henkilö, josta päättää patent-
11 83667 ti- ja tuotemerkkien tarkastaja, johon hän on oikeutettu 37 C.F.R. 1.14 ja 35 U.S.C. 122 perusteella ja kaikki rajoitukset HB8331, HB8332, HB8403, HB8404 ja HB8405 saatavuuden suhteen yleisölle tullaan peruuttamattomasti pois- 5 tamaan, kun patenttihakemukselle on myönnetty patentti. Nro:t slc4, HB8333, s3d3, HB8331 ja sle4, HB8332 talletettiin ATCC:hen 11 elokuuta 1983. Uudet monoklonaaliset vasta-aineet nro:t s5b9, HB8402, s5e5, HB 8403, sla, HB8404 ja s2g8, HB8405 talletettiin ATCC:hen lokakuun l:nä 10 päivänä 1983.
12 83667 Patenttivaatimukset 1. Menetelmä monoklonaalisten vasta-aineiden valmistamiseksi hybridoomilla, tunnettu siitä, että 5 valmistetaan vasta-aine, joka reagoi spesifisesti Eimeria tenella:n itiöitten antigeenien kanssa, joiden molekyylipaino on noin 13-150 kd, hybridoomilla, jotka on muodostettu yhdistämällä hiiren P3 x 63.Ag8.653 myeloomasoluja ja pernasoluja, jotka on saatu BALB/c hiiristä, jotka on 10 aiemmin immunisoitu E. tenella'n itiöillä, joille hybridoomille on annettu klooninumero s5e5 (ATCC HB8403); klooninumero s4e2; klooninumero slc4 (ATCC HB8333); klooninumero s2g8 (ATCC HB8405); klooninumero s5b9 (ATCC HB8402); klooninumero sla (ATCC HB8404); klooninumero s3c11, kloo- 15 ninumero s3d3 (ATCC HB8331); tai klooninumero sle4 (ATCC HB8332). 2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että viljellään kloonit nro s5e5 (ATCC HB8403), s4e2, slc4 (ATCC HB8333), s2g8 (ATCC 20 HB8405), s5b9 (ATCC HB8402), sla (ATCC HB8404), s3c11, s3d3 (ATCC HB8331) tai sle4 (ATCC HB8332) sopivassa elatusaineessa ja vasta-aine otetaan talteen yllämainitun hybridoomaviljelmän supernatantista; tai hiireen injektoidaan hybridoomaviljelmä, jonka klooninumero on s5e5 (ATCC 25 HB8403), s4e2, slc4 (ATCC HB8333), s2g8 (ATCC HB8405), s5b9 (ATCC HB8402), sla (ATCC HB8404), s3c11, s3d3 (ATCC HB8331) tai sle4 (ATCC HB8332) ja kyseinen vasta-aine otetaan talteen kyseisen hiiren vesivatsasta tai seerumista. 3. Menetelmä rokotteen valmistamiseksi, joka rokote 30 on liukoinen läsnäolevaan detergenttiä sisältävään puskuriliuokseen ja joka on Eimeria tenella'n itiöiden antigeeni, joka on spesifisesti reaktiivinen hybridoomakloonin s5e5 (ATCC nro HB8403) erittämien itiö-vastaisten monoklonaalisten vasta-aineiden kanssa ja jonka molekyylipaino on 35 110 ± 16 kd ja 130 ± 20 kd; spesifisesti reaktiivinen hyb-
13 83667 ridoomakloonin s4e2 erittämien itiö-vastaisten monoklonaalisten vasta-aineiden kanssa ja jonka molekyylipaino on 110 ± 16 kd ja 130 ± 20 kd; spesifisesti reaktiivinen hybridoomakloonin slc4 (ATCC nro HB8333) erittämien itiövas- 5 taisten monoklonaalisten vasta-aineiden kanssa ja antigeenin molekyylipaino on 66 ± 9 kd, 55 ± 8 kd, 20-30 kd, 18 ± 3 kd, 15 ± 2 kd; spesifisesti reaktiivinen hybridoomakloonin s2g8 (ATCC nro HB8405) erittämien itiövastaisten monoklonaalisten vasta-aineiden kanssa ja jonka molekyyli- 10 paino on 55 ± 8 kd; spesifisesti reaktiivinen hybridoomakloonin s5b9 (ATCC nro HB8402) erittämien itiövastaisten monoklonaalisten vasta-aineiden kanssa ja jonka molekyylipaino on 55 ± 8 kd; spesifisesti reaktiivinen hybridoomakloonin sla (ATCC nro HB8404) erittämien itiövastaisten 15 monoklonaalisten vasta-aineiden kanssa ja jonka molekyylipaino on 54 ± 8 kd; spesifisesti reaktiivinen hybridoomakloonin s3c11 erittämien itiö-vastaisten monokloonaalisten vasta-aineiden kanssa ja jonka molekyylipaino on 50 ± 7 kd; spesifisesti reaktiivinen hybridoomakloonin s3d3 (ATCC 20 nro HB8331) erittämien itiö-vastaisten monoklonaalisten vasta-aineiden kanssa ja jonka molekyylipaino on 29 ± 4 kd; tai spesifisesti reaktiivinen hybridoomakloonin sle4 (ATCC nro HB8332) erittämien itiö-vastaisten monoklonaalisten vasta-aineiden kanssa ja jonka molekyylipaino on 58 25 ± 9 kd ja 130 ± 20 kd, tunnettu siitä, että siihen kuuluu vaiheet, joissa a) uutetaan E. tenella'n itiöantigeenejä ja tehdään ne liukoisiksi; b) erotetaan liuennut aine tavanomaisilla eristys- ja puh- 30 distusmenetelmillä puhdistetun antigeenin saamiseksi.
14 83667 Patentkrav 1. Förfarande för framställning av monoklonala antikroppar med hybridom, k ä n n e t e c k n a t därav, 5 att man framställer antikroppar, som reagerar specifikt med antigener av Eimeria tenellas sporozoiter med en molekylvikt på ungefär 13-150 kd, med hybridom som bildats genom fusion av P3 x 63.Ag8.653-myelomceller från möss och mjältceller från BALB/c-möss, vilka tidigare immuniserats 10 med E-tenella-sporozoiter, vilka hybridom betecknats med klonnumret s5e5 (ATCC HB8403); klonnumret s4e2; klonnumret slc4 (ATCC HB8333); klonnumret s2g8 (ATCC HB8405); klonnumret s5b9 (ATCC HB8402); klonnumret sla (ATCC HB8404); klonnumret s3c11; klonnumret s3d3 (ATCC HB8331); eller 15 klonnumret sle4 (ATCC HB8332). 2. Förfarande enligt patentkravet 1, kännetecknat därav, att man odlar klon nr s5e5 (ATCC HB8403), s4e2, slc4, (ATCC HB8333), s2g8 (ATCC HB8405), s5b9 (ATCC HB8402), sla (ATCC HB8404), s3c11, s3d3 (ATCC 20 HB8331) eller sle4 (ATCC HB8332), i ett lämpligt medium och utvinner antikroppen från vätskan ovanför nämnda hybridomodling; eller injicerar i en mus en hybridomkultur, vilken betecknats med klonnummer s5e5 (ATCC HB8403), s4e2, slc4 (ATCC HB8333), s2g8 (ATCC HB8405), s5b9 (ATCC 25 HB8402), sla (ATCC HB8404), s3c11, s3d3 (ATCC HB8331) eller sle4 (ATCC HB8332) och utvinner nämnda antikropp från askites eller serumet från ifrågavarande mus. 3. Förfarande för framställning av ett vaccin, vilket är lösligt i en närvarande detergenthaltig buffertlös- 30 ning och som är en antigen av Eimeria tenella-sporozoiter, vilken antigen är specifikt reaktiv med monoklonala antisporozoitantikroppar, vilka utsöndrats av hybridomklonen s5e5 (ATCC nr HB8403) och har molekylvikter på 110 ± 16 kd och 130 ± 20 kd; är specifikt reaktiv med monoklonala an- 35 ti-sporozoitantikroppar, vilka utsöndrats av hybridomklon
15 83667 s4e2 och har molekylvikter på 110 ± 16 kd och 130 ± 20 kd; specifikt reaktiv med monoklonala anti-sporozoitantikroppar, vilka utsöndrats av hybridomklon slc4 (ATCC nr HB8333) och har molekylvikter på 66 ± 9 kd, 55 ± 8 kd, 5 20-30 kd, 18 ± 3 kd, 15 ± 2 kd; specifikt reaktiv med monoklonala anti-sporokoitantikroppar, vilka utsöndrats av hybridomklon s2g8 (ATCC nr HB8405) och har molekylvikten 55 ± 8 kd; specifikt reaktiv med monoklonala anti-sporozoitantikroppar, vilka utsöndrats av hybridomklon s5b9 10 (ATCC nr HB8402) och har molekylvikten 55 ± 8 kd; specifikt reaktiv med monoklonala anti-sporozoitantikroppar, vilka utsöndrats av hybridomklon sla (ATCC nr HB8404) och har molekylvikten 54 ± 8 kd; specifikt reaktiv med monoklonala anti-sporozoitantikroppar, vilka utsöndrats av 15 hybridomklon s3c11 och har molekylviktern 50 ± 7 kd; specifikt reaktiv med monoklonala anti-sporozoitantikroppar, vilka utsöndrats av hybridomklon s3d3 (ATCC nr HB8331) och har molekylvikten 29 ± 4 kd; eller är specifikt reaktiv med monoklonala anti-sporozoitantikroppar, vilka utsönd- 20 rats av hybridomklon sle4 (ATCC nr HB8332) och har molekylvikten 58 ± 9 kd och 130 ± 20 kd; känneteckn a t därav, att det omfattar skeden där man a) extraherar och solubiliserar sporozoitantigener av E. tenella; 25 b) separerar det solubiliserade materialet genom sedvanliga isolerings- och reningsprocedurer för erhållande av renad antigen.