Petri Passoja IONINESTELIUOSTEN TUTKIMINEN IONIKROMATOGRAFIALLA

Petri Passoja IONINESTELIUOSTEN TUTKIMINEN IONIKROMATOGRAFIALLA Opinnäytetyö KESKI-POHJANMAAN AMMATTIKORKEAKOULU Kemiantekniikan koulutusohjelma Kesäkuu 2008

SISÄLLYS TIIVISTELMÄ ABSTRACT LYHENTEET SANASTO 1 JOHDANTO 1 2 IONINESTEET 2 2.1 Ioninesteiden määritelmä 2 2.2 Ioninesteiden käyttökohteita 4 2.3 Ioninesteisiin liittyviä epäkohtia 6 3 IONIKROMATOGRAFIA 7 3.1 Kromatografia 8 3.2 Ionikromatografian toiminta 9 3.3 Ionikromatorafian laitteisto 10 3.4 Kromatogrammin tulkinta 16 3.5 Komponenttien erotukseen vaikuttavat tekijät 17 4 IONIKROMATOGRAFISIA MENETELMIÄ 19 4.1 Betaiinin, koliinin ja trimetyyliamiinin määritys 19 4.2 Ilmakehän raskasmetallien analysointi ionikromatografialla 21 4.3 Yleisten kationeiden ja eräiden siirtymämetallien tutkiminen ionikromatografialla 23 4.4 Epäorgaanisten anionien ja metalli-ionien samanaikainen määritys 24 4.5 Yleisten epäorgaanisten anionien ja kationien määritys 25 4.6 Menetelmä betaiinin ja N,N-dimetyyliglysiinin määrittämiseen verestä ja virtsasta 27 4.7 Uusia strategioita siirtymämetallien määrittämiseen 28 4.8 Ionivahvuuden, ph:n ja lämpötilan vaikutukset siirtymä- ja raskasmetalli-ioneiden selektiivisyyteen 30 4.9 Laitteistovalmistajan sovellusohjeita 33 5 KOKEELLINEN OSUUS 34 5.1 Käytetty laitteisto ja analysointiolosuhteet 34 5.2 Koeajot 36 5.2.1 Koliinikloridin ja betaiinin tunnistaminen ja kalibrointisuorien määrittäminen 36 5.2.2 Betaiinin ja koliinikloridin määritys 2-komponenttiliuoksesta 38 5.2.3 Reniumin määritys 38 5.2.4 Koboltin määritys 39 5.2.5 Monovalenttisen kationin määritys 39 5.2.6 Kationien määritys monialkuainestandardiliuoksesta 40 6 TULOKSET 41 6.1 Koliinikloridin ja betaiinin tunnistaminen sekä kalibrointisuorien määrittäminen 41 6.2 Betaiinin ja koliinikloridin määritys 2-komponenttiliuoksesta 44

6.3 Reniumin määritys 48 6.4 Koboltin määritys 48 6.5 Monovalenttisen kationin määritys 48 6.6 Kationien määritys monialkuainestandardiliuoksesta 49 6.7 Betaiinin ja koliinikloridin retentioaikojen tarkastelu eri ajo-olosuhteissa 50 6.8 Yhteenveto kvalitatiivisista ja kvantitatiivisista analysoinneista 51 7 POHDINTA 53 LÄHTEET 55 LIITTEET LIITE 1. Metrohmin sovellusohje C-55 LIITE 2. 8 ppm koliinikloridin ajo-olosuhteet ja kromatogrammi LIITE 3. 20 ppm koliinikloridin ajo-olosuhteet ja kromatogrammi LIITE 4. 40 ppm koliinikloridin ajo-olosuhteet ja kromatogrammi LIITE 5. 40-prosenttisen koliinikloridin piikit limittäin LIITE 6. 40-prosenttisen koliinikloridin kalibrointisuora LIITE 7. 2 ppm betaiinin ajo-olosuhteet ja kromatogrammi LIITE 8. 5 ppm betaiinin ajo-olosuhteet ja kromatogrammi LIITE 9. 10 ppm betaiinin ajo-olosuhteet ja kromatogrammi LIITE 10. 20 ppm betaiinin ajo-olosuhteet ja kromatogrammi LIITE 11. 200 ppm kaliumin ajo-olosuhteet ja kromatogrammi LIITE 12. 100 ppm kaliumin ajo-olosuhteet ja kromatogrammi LIITE 13. 50 ppm kaliumin ajo-olosuhteet ja kromatogrammi

TIIVISTELMÄ OPINNÄYTETYÖSTÄ Yksikkö Tekniikan ja liiketalouden yksikkö Aika 16.5.2008 Tekijä/tekijät Petri Passoja Koulutusohjelma Kemiantekniikka Työn nimi Ioninesteliuosten tutkiminen ionikromatografialla Työn ohjaaja DI, KM Maija Rukajärvi-Saarela Sivumäärä 57 + 13 Työelämäohjaaja fil. lis. Toni Andersson Critical Solution Technologies Ltd:n toimeksiantama tutkimus suoritettiin Teknologiakeskus KETEK Oy:llä. Työn tarkoituksena oli tutkia ionikromatografian soveltuvuutta betaiini- ja koliinikloridipohjaisten metalleja sisältävien ioninesteliuosten kvalitatiiviseen ja kvantitatiiviseen analysointiin. Analysoitavat komponentit valittiin Critical Solution Technologies Ltd:n tutkimuskohteisiin liittyen. Ionikromatografiset määritykset suoritettiin laboratoriossa valmistetuille 1- ja monikomponenttiliuosnäytteille, joilla pyrittiin jäljittelemään työn toimeksiantajan liiketoiminnassaan ja tutkimuksissaan hyödyntämiä liuoksia. Tutkittavia komponentteja olivat betaiinin ja koliinikloridin lisäksi koboltti ja renium. Ionikromatografisissa koeajoissa sovellettiin laitteistotoimittajalta saatuja sekä tieteellisissä julkaisuissa esiteltyjä analyysiparametrejä. Tutkimukselle asetetut tavoitteet saavutettiin betaiinin ja koliinikloridin kvalitatiivisessa ja kvantitatiivisessa analysoinnissa. Oikeiden analysointiparametrien valinnalla kyseisten yhdisteiden analysointi oli mahdollista. Koliinikloridin ja betaiinin ionikromatografisessa analysoinnissa suositellaan käytettäväksi heikkoa kationinvaihtokolonnia sekä eluenttina liuosta, joka koostuu metaanisulfonihaposta ja asetonitriilistä tai typpihaposta ja 2,6-dikarboksyylihaposta. Kirjallisuudessa esitetyistä tutkimustuloksista poiketen koboltin ja reniumin määritys ei kuitenkaan ollut mahdollista käytössä olleet matriisit ja analyysiolosuhteet huomioiden. Koeajoissa käytetyt kolonnit erosivat kirjallisuudessa esitetyissä tutkimuksissa käytetyistä kolonneista, minkä todettiin mm. osittain olevan syynä metallien määrittämisen epäonnistumiseen. Asiasanat ioninesteet, ionikromatografia

TIIVISTELMÄ OPINNÄYTETYÖSTÄ

ABSTRACT CENTRAL OSTROBOTHNIA UNIVERSITY OF APPLIED SCIENCES Date 16 May, 2008 Author Petri Passoja Degree programme Chemical Engineering Name of thesis Determination of Ionic Liquid Solutions with Ionchromatography Instructor Maija Rukajärvi-Saarela Pages 57 + 13 Appendices Supervisor Toni Andersson This thesis was made for Critical Solution Technologies Ltd. at Technology Centre Ketek Ltd. The purpose of this study was to find out the applicability of ionchromatography for qualative and quantative determination of metal containing betaine and choline chloride based ionic liquid solutions. Ion chromatography analyses were performed for synthetic solutions imitating the real solutions utilised by Critical Solution Technologies Ltd. The analysed components were: betaine, choline chloride, cobalt and rhenium. The analyses parameters were chosen according to the instructions of the equipment supplier and according to the information of scientific publications. Good results were achieved with the determinination of betaine and choline chloride. As a result, qualitative and quantitative analysis were possible of those compounds. The analyses can be performed by using a weak cation exchange column and an eluent containing methanesulphonic acid and acetonitrile or nitric acid and dipicholinic acid. On the other hand, the determination of cobalt and rhenium was not possible in this case. The metal analysis was not successful because the columns used differed from those of mentioned in a literature. Key words ionic liquids, ionchromatography

LYHENTEET 5-Br-BADAP 2-(5-bromo-2-pyridylazo)-5-dietyyliaminofenoli DMG N,N-dimetyyliglysiini EDTA Etyleenidiamiinitetraetikkahappo HPLC Korkean erotuskyvyn nestekromatografia IDA Iminodiasetaattihappo MSA Metaanisulfonihappo Na 2 EDTA Etyleenidiamiinitetraetikkahapon dinatriumsuola PAR 4-(2-pyridylazo) resorisinoli RSD Suhteellinen keskihajonta TMA Trimetyyliamiini

SANASTO Gradienttieluutio: luointi, jossa liikkuvan faasin koostumusta muutetaan jatkuvasti tai portaittain (askeleluutio). (Franzen 2005, 35). Hydrofobinen: aine tai sen osa, jonka polaarittomat molekyylit eivät liukene veteen. (Tieteen tietotekniikan keskus CSC; Farabee 2006). Hydrofiilinen: aine tai sen osa, jonka pooliset molekyylit liukenevat veteen. (Farabee 2006). Isokraattinen eluointi: eluointi, jossa liikkuvan faasin koostumus pysyy vakiona. (Franzen 2005, 35). Kromatografia (engl. chromtography): erotusmenetelmä, joka perustuu komponenttien jakautumiseen stationäärifaasin ja liikkuvan faasin välille. (Riekkola 1995, 1.) Kromatogrammi (engl. chromatogram): graafinen esitys, josta nähdään eluentin sisältämien komponenttien konsentraatiot tilavuuden tai ajan funktiona. (Riekkola 1995, 1.) Liikkuva faasi (engl. mobile phase): eluentti, joka liikkuu stationäärifaasin pinnalla tai sen läpi. Liikkuva faasi voi olla neste, kaasu tai ylikriittinen fluidi. (Riekkola 1995, 2.) Stationäärifaasi (engl. stationary phase): paikallaan pysyvä faasi, joka voi olla kiinteä, geeli tai neste. (Riekkola 1995, 1.) Ylikriittinen fluidi: määrätty yhdisteen, seoksen tai alkuaineen olomuoto sen kriittisen paineen ja lämpötilan yläpuolella (Riekkola 1995, 78).

1 1 JOHDANTO Ioninesteiden ylivertaiset ominaisuudet mm. liuottimina ovat saaneet aikaan räjähdysmäisen tutkimusten lisääntymisen viimeisten kymmenen vuoden sisällä. Kiristyvän ympäristölainsäädännön myötä liuottimien ja muiden kemiallisten yhdisteiden haittavaikutuksiin on yhä enemmän kiinnitetty huomiota. Lisääntyneeen tukimuksen myötä ioninesteitä voidaan hyödyntää mm. konventionaalisten orgaanisten liuottimien korvaajina ympäristöystävällisempien vaikutustensa ja liuotintehokkuutensa vuoksi. Ioninesteissä käytettävien vaihtoehtoisten komponenttiyhdistelmien sekä liuosten sisältämien muiden alkuaineiden ja yhdisteiden suuren määrän vuoksi seosten analysointi asettaa nykytutkimukselle ja etenkin analyysien menetelmäkehitykselle suuria haasteita. Tästä syystä spesifioiduista komponenttiyhdistelmistä ei ole aina saatavilla aikaisemmin julkaistua tutkimustietoa. Opinnäytetyö tehtiin Teknologiakeskus KETEK Oy:lle Critical Solution Technologies Ltd:n toimeksiannosta. Tutkimuksen tavoitteena oli ioninesteissä käytettävien kationikomponenttien, betaiinin ja koliinikloridin, sekä koboltin ja reniumin kvlitatiivinen ja kvantitatiivinen määrittäminen synteettisistä näytteistä ionikromatografian avulla. Analysoitavat komponentit valittiin Critical Solution Technologies Ltd:n tutkimuskohteisiin liittyen. Ionikromatografiset määritykset suoritettiin laboratoriossa valmistetuille sekä 1- että monikomponenttiliuosnäytteille, joilla pyrittiin jäljittelemään todellisia, työn toimeksiantajan liiketoiminnassaan ja tutkimuksissaan hyödyntämiä liuoksia. Ionikromatografisissa koeajoissa sovellettiin pitkälti laitteistovalmistajalta saatuja sekä tieteellisissä julkaisuissa esiteltyjä analyysiparametrejä.

2 2 IONINESTEET Ioniset nesteet eli suolasulat ovat liuottimia, jotka koostuvat kokonaan ioneista. Ioninesteiden ylivertaiset ominaisuudet ovat herättäneet runsaasti mielenkiintoa ympäri maailmaa. Niiden avulla voidaan alentaa teollisuuden tuotantokustannuksia, ja laajamittaisen käytön myötä myös saastekuormitus pienentyy huomattavasti. Ioninesteet ovat sekä potentiaalisia että haasteellisia vaihtoehtoja perinteisten liuottimien rinnalla. (Mikkola 2005.) Liuottimet ovat usein välttämättömiä kemiallisissa reaktioissa. Kiristyvän ympäristölainsäädännön myötä liuottimien ja muiden kemiallisten yhdisteiden haittavaikutuksiin on yhä enemmän kiinnitetty huomiota. Ympäristönsuojelun näkökulmasta katsottuna ideaalisen liuottimen tulisi olla kemiallisesti ja fysikaalisesti stabiili, kierrätettävä sekä helposti käsiteltävä. (Kärkkäinen 2007, 15 16.) Tämän lisäksi liuottimella tulisi olla hyvin alhainen haihtuvuus ja syttyvyys. Liuottimen tulisi olla inertti, mutta kuitenkin tehokas. Lisäksi hankintakustannusten tulisi olla matalat. Muita suotuisia tekijöitä ovat mm. myrkyttömyys sekä kohtuullinen pinta-aktiivisuus. (Rogers & Seddon 2002, 6.) Kemianteollisuudessa on suunnilleen 300 orgaanista liuotinta, mutta ioninesteitä on yli triljoona. Ioninesteiden ominaisuuksista on vähän tietoa, mitä voidaan pitää niiden huonona puolena. (Metrohm 2004.) Edellä mainitut tekijät huomioiden ioninesteitä voidaan pitää varteenotettavina vaihtoehtoina kemiallisissa prosesseissa perinteisten orgaanisten liuottimien korvaajina. (Kärkkäinen 2007, 15 16.) 2.1 Ioninesteiden määritelmä Ionit ovat sähköisesti varautuneita atomeja tai atomiryhmiä. Negatiivisesti varautunut ioni on anioni ja positiivisesti varautunut on kationi. Useimmat ioninesteet koostuvat orgaanisesta kationista ja epäorgaanisesta, moniatomisesta anionista. Koska ioninesteitä voidaan valmistaa yhdistämällä kationi ja anioni keskenään, erilaisia yhdistelmiä on erittäin paljon. (Mikkola 2005.) Ioninesteiden yleisen määritelmän mukaisesti kyseisten suolojen sulamispiste on alle 100 C. Tärkeimpiä ominaisuuksia ovat mm. lämmönkestävyys, matala höyrynpaine, sähkönjohtokyky, muokattava liukoisuus, nestekiderakenne, korkea elektroelasti-

3 suus, korkea lämpöarvo ja matala tulenarkuus. Edellä mainittujen ominaisuuksien lisäksi ioninesteet ovat sekä hydrofobisia että hydrofiilisia. Käytettävän anionin laatu sekä kationiin liitettyjen alkyyliryhmien määrä ja pitoisuus vaikuttavat veteen liukenevuuteen. (Kärkkäinen 2007, 22 23; EMD, 3; Huddleston & Visser & Reichert & Willauer & Broker & Rogers 2001, 156.) Veteen liukenevuuden lisäksi ioninesteiden muihin kemiallisiin ja fysikaalisiin ominaisuuksiin voidaan myös vaikuttaa erilaisten kationien ja anionien yhdistelmien valinnalla. Myös kaksi- tai kolmiarvoisten ioninesteiden valmistaminen on mahdollista sekoittamalla ioninesteitä keskenään. Haihtuviin orgaanisiin yhdisteisiin verrattuna ioninesteet eivät haihdu eivätkä pala helposti matalan höyrynpaineensa ansiosta. (Kärkkäinen 2007, 2 ja 22 23.) Kuvioissa 1 ja 2 on esitetty yleisimmin käytetyt kationit ja anionit. Kuvioiden lyhenteet R 1, R 2, R 3 ja R 4 ovat alkyyliryhmiä, joiden ketjujen pituudet vaihtelevat. KUVIO 1. Ioninesteiden yleisimmin käytetyt kationit (Kärkkäinen 2007, 22; Rogers & Seddon 2003, 71.)

4 KUVIO 2. Ioninesteiden yleisimmin käytetyt anionit (Kärkkäinen 2007, 22.) 2.2 Ioninesteiden käyttökohteita Tyypillisiä syntetiikassa käytettyjä reaktioita, joissa hyödynnetään ioninesteitä, ovat mm. emäskatalysoidut reaktiot, hapettumisreaktiot ja radikaalireaktiot (Piukka 2007, 10). Kuviossa 3 on esitelty ioninesteiden tyypillisimpiä käyttökohteita.

5 KUVIO 3. Ioninesteiden käyttökohteita (Kärkkäinen 2007, 23.) Ioninesteitä hyödynnetään nykyisin teollisissa prosesseissa ja niiden mahdollisia käyttökohteita tutkitaan jatkuvasti. Ioninesteillä on ainutlaatuisia liuotusominaisuuksia, jotka parantavat hankalienkin raaka-aineiden hyödyntämistä. Esimerkiksi vaikealiukoisen selluloosan liuottaminen ioninesteellä onnistuu muutamassa minuutissa, kun aikaisemmin julkaistujen tutkimusten mukaan liuottaminen kestäisi useita tunteja. Myös suuria määriä erilaisia sokereita, kuten mono-, di- ja oligosakkarideja, pystytään liuottamaan ioninesteisiin. Tutkimusten mukaan eritoten erilaiset disyanoamidi-anionipohjaiset yhdisteet ovat siinä tehokkaita. Ioninesteet pystyvät liuottamaan selluloosan ja sokereiden lisäksi myös silkkikuituja, kitiiniä, kitosaania ja entsyymejä. Ioninesteiden ylivertaiset liuotinominaisuudet eivät ole niiden ainut ominaisuus, vaan niitä voidaan käyttää myös mm. uusien materiaalien valmistuksessa, malmien erotuksessa, lääkeaineiden synteesissä, lämmönsiirrossa, aurinkoenergian tuotannossa, paristoissa, polttokennoissa ja jopa antenniteknologiassa. (Mikkola 2005, 2006.)

6 2.3 Ioninesteisiin liittyviä epäkohtia Vaikka ioninesteet eivät haihdu helposti, voivat ne kuitenkin hajota korkeissa lämpötiloissa. Hajoamislämpötilaan vaikuttavat varsinkin ioninesteen sisältämät anionit. Matala sulamispiste ja vähäinen höyrynpaine saavat aikaan laajan nestemäisen olotilan lämpötilaskaalan. Yleensä tämä alue on yli 300 400 C. Esimerkiksi vesi on nesteenä lämpötila-alueella 0 100 C. (Kärkkäinen 2007, 2, 22 23.) Muutamat ioninesteet ovat tavanomaisia orgaanisia liuottimia myrkyllisempiä, sillä alkyyliketjun pidetessä kyseisen ioninesteen myrkyllisyys kasvaa. Hyvän vesiliukoisuutensa myötä ioninesteet voivat myös saastuttaa vesistöjä. Alhaisen höyrynpaineensa vuoksi niiden ei kuitenkaan uskota vaikuttavan ilmastoon. Käytettävien lähtöaineiden mukaan jotkut ioninesteet ovat melko kalliita, jolloin niiden kierrättäminen on jo taloudellisistakin syistä välttämätöntä. (Kärkkäinen 2007, 40 42; Mikkola 2006.) Ioninesteiden fysikaalis-kemialliset ominaisuudet ovat vielä huonosti tunnettuja. Jotkut palavat pieninä sumupisaroina, ja jotkut ovat myrkyllisiä ja huonosti biohajoavia. Toisaalta on myös hyvin halpoja, myrkyttömiä, palamattomia ja täysin biohajoavaisia ionisia nesteitä. Niiden kierrättämisestä on saatu hyviä tuloksia. Kokonaisuudessaan ioninesteet ovat kuitenkin orgaanisia liuottimia paljon vaarattomampia verrattaessa keskenään kyseisten yhdisteiden kaikkia hyötyjä ja haittoja. (Kärkkäinen 2007, 40 42; Mikkola 2006.)

7 3 IONIKROMATOGRAFIA Ionikromatografia on ioniliuoksille soveltuva analyyttinen erotus- ja mittausmenetelmä, joka perustuu ionien tarttumiseen stationäärifaasiin sähköisten voimien avulla. Ioninvaihtokolonnissa on paikat, johon vastakkaismerkkiset ionit voivat tarttua. Detektori piirtää ionien liikkuvuuden perusteella kromatogrammin, josta nähdään yhdisteiden ominaisuuksia. (Jaarinen & Niiranen 2005, 165 168.) Sana kromatografia juontuu kreikan kielen sanasta: "chromatos", joka merkitsee väriä (Kortesharju 2001). Kromatografian keksijänä pidetään venäläistä M. S. Tswetiä, joka vuonna 1903 erotti kasvien lehtien väriaineseoksesta eri komponentteja antamalla väriaineseoksen kulkeutua liuottimen mukana adsorbenssipylvään läpi (Huttula 2007, 10). Sen jälkeen kromatografiasta on tullut korvaamaton laboratoriotutkimusmenetelmä. Samat periaatteet pätevät yhä, vaikka väreillä ei enää olekaan merkitystä kromatografiassa. (History of chromatography.) 1960 -luvulla esitelty korkean erotuskyvyn nestekromatografia (HPLC) kehitettiin yhdeksi tärkeimmistä ja hyödyllisimmistä erotusmenetelmistä. (Schäfer & Läubli & Dörig, 2.) 15 vuotta myöhemmin vuonna 1975 Small ym. esittelivät ionikromatografian, josta lyhyessä ajassa kehiteltiin itsenäinen analyyttinen tekniikka. Nykyään kyseinen tekniikka sisältää kaikki HPLC:n menetelmät määriteltäessä orgaanisia tai epäorgaanisia ioneja. (Schäfer ym. 2; Haddad & Jackson 2003, 6.) Ionikromatografia yleistyi erittäin nopeasti, koska sillä sen myötä ensimmäistä kertaa kyettiin määrittämään luotettavasti ja tarkasti useita epäorgaanisia kationeita ja anioneita samanaikaisesti. Ionikromatografian kehityksen alkuvuosina menetelmää käytettiin pääasiassa epäorgaanisissa analyyseissa, mutta myöhemmin sen huomattiin soveltuvan myös orgaanisille liuoksille. (Haddad & Jackson 2003, 6.)

8 3.1 Kromatografia Kromatografia on seosten analyyttinen erotusmenetelmä, joka perustuu aineen jakautumiseen kahden faasin kesken, liikkuvan faasin (engl. mobile phase) ja kiinteän faasin (engl. stationary phase). Kiinteä faasi voi olla neste tai jokin kiinteä aine. Liikkuva faasi voi puolestaan olla neste tai kaasu. (Schäfer ym. 1.) Molekyylien jakautuminen kahden faasin välille määräytyy haihtuvuuden, adsorptio-ominaisuuksien ja liukoisuuden perusteella. Koska liikkuva faasi liikkuu kiinteän faasin pinnalla tai sen läpi, faasit eivät saa liueta toisiinsa. (Westerholm 1985, 17; Opetushallitus.) Faasien toimintaperiaate on esitetty kuviossa 4. Kuviolla havainnollistetaan liuoksen sisältämien molekyylien (mustat täplät) jakautumisesta stationäärifaasin ja liikkuvan faasin välillä. Erotus on tehokkaampaa kuviossa (b). KUVIO 4. Faasien toimintaperiaate (Haddad & Jackson 2003, 3.) Kromatografisia erotustekniikoita on useita. Yleisimpiä näistä ovat kaasu- ja nestekromatografia. Kaasukromatografiassa liikkuvana faasina on kaasu ja nestekromatografiassa neste. Nestekromatografia sisältää myös seuraavat menetelmät: pylväskromatografia ohutlevykromatografia paperikromatografia sekä ionikromatografia. (Opetushallitus.)

9 3.2 Ionikromatografian toiminta Ionikromatografia perustuu yleisiin neste-kiinteäainekromatografiamenetelmiin, joissa eluentti (neste) johdetaan stationäärifaasin läpi detektorille. Näyte syötetään korkeapaineiseen eluenttiin injektorilla, minkä jälkeen pumppu kuljettaa eluentin kolonnin läpi (kuvio 5). Näytteen komponentit läpäisevät kolonnin eri nopeuksilla, joten komponenteille syntyy omat piikit kromatogrammiin detektorin havaitessa ne kuvion 6 mukaisesti. Ionikromatografian laitteet näkyvät kaavamaisesti kuviossa 5. (Haddad & Jackson 2003, 1.) KUVIO 5. Ionikromatografian laitteet (Haddad & Jackson 2003, 1.) KUVIO 6. Kahden komponentin (A ja B) erotus ionikromatografialla (Haddad & Jackson 2003, 2.)

10 3.3 Ionikromatorafian laitteisto Ionikromatografian laitteisto koostuu pääasiassa seuraavista laitteista: pumppu, ioninvaihtokolonni (kationivaihto- tai anioninvaihtokolonni), injektori, detektori ja supressori. Teknologiakeskus KETEK Oy:llä on käytössä kuvion 7 mukainen ionikromatografialaitteisto. KUVIO 7. Ionikromatografialaitteisto (Metrohm, Ion analysis.) Pumpun (kuvio 8) tehtävä on kuljettaa eluentti tasaisella virtausnopeudella vastapainetta vastaan. Virtausnopeuteen vaikuttavat seuraavat suureet: eluentin viskositeetti, kolonnin dimensiot sekä stationäärifaasin hiukkas- ja huokoisuuominaisuudet. Yleensä pumpun virtausnopeus on säädettävissä 0,1 ml/min 15 ml/min. (Jaarinen & Niiranen 2005, 163). Teknologiakeskus KETEK Oy:ssä käytössä oleva ionikromatografialaitteiston pumppu on tarkoitettu pienemmille virtauksille (0,05 ml/min 5,00 ml/min). (Methrom, IC Pump 2003, 36.) Mittaustulosten luotettavuuden kannalta on tärkeää huolehtia, ettei pumppuun pääse ilmakuplia (Jaarinen & Niiranen 2005, 163).

11 KUVIO 8. Ionikromatografialaitteiston pumppu (Metrohm, Ion analysis.) Kolonni on valmistettu ruostumattomasta teräksestä tai muovista. Se on yleensä 5 30 cm korkea, ja sen sisähalkaisija on 4 9 mm. Kolonnin sisällä oleva hartsi koostuu pienistä (esim. 5µm) yhdenmuotoisista partikkeleita, jotka muodostavat stationäärifaasin. Erotus on sitä tehokkaampaa, mitä pienempiä partikkelit ovat, koska silloin yhdisteiden erottumiseen on enemmän pinta-alaa. (Haddad & Jackson 2003, 1; Jaarinen & Niiranen 2005, 154.) Analyyttisen kolonnin lisäksi voidaan käyttää myös suojakolonnia, joka estää analyyttisen kolonnin likaantumisen (Cardellicchio & Cavalli & Ragone & Riviello 1999, 252). Ioninvaihtokolonni ja sen rakenne kaaviokuvana on esitetty kuviossa 9. Ioninvaihtohartseja on neljää eri päätyyppiä: vahvoja ja heikkoja kationinvaihtajia sekä vahvoja ja heikkoja anioninvaihtajia. Vahvat kationinvaihtajat soveltuvat raskasmetallien (kuten Fe, Cd, Ag, Au, Hg) poistoon, kun taas heikot kationinvaihtajat soveltuvat orgaanisten emästen poistamiseen. Vahvat anioninvaihtajat poistavat kaikki mineraalihapot (heikot ja vahvat), ja heikot anioninvaihtajat poistavat pelkästään vahvat mineraalihapot. (Siivinen & Mahiout 1999, 47.)

12 KUVIO 9. Ioninvaihtokolonni (Resolutions), ja sen rakenne (Haddad & Jackson 2003, 18.) Injektoreita on sekä automaattisia että käsikäyttöisiä. Rheodyne-näytesilmukkainjektorit ovat käsi-injektoreita, jotka syöttävät näytteen suuripaineeseen nestevirtaan. Käsikäyttöinen injektori on esitetty kuviossa 10. Eluointiliuos virtaa silmukan ohi kolonniin, ja injektori yhdistää silmukan korkeapaineiseen eluenttiin, jonka avulla näyte siirtyy kolonniin. Automaattisesta injektoinnista poiketen käsin suoritettavassa injektoinnissa kapillaarisilmukka on vaihdettava injektiotilavuuksien muuttuessa. Automaattisessa tekniikassa kapillaarisilmukan injektiotilavuudet ovat sen sijaan vaihdettavissa automaattisesti. Näytejonoon on kuitenkin syötettävä säännöllisesti nollanäytteitä siten, että nollanäytteen edellä on suuripitoinen kalibrointi tai kontrolliliuos. (Jaarinen & Niiranen 2005, 165.) Teknologiakeskus KETEK Oy:llä on käytössä automaattinen injektori.

13 KUVIO 10. Rheodyne-injektorin rakenne ja toiminta (Jaarinen & Niiranen 2005, 165). Nestekromatografian detektoreita on useita erilaisia. Detektorin tarkoituksena on mitata yhdisteen signaali ajan funktiona ja piirtää kromatogrammi, josta komponentit ovat erotettavissa. (Jaarinen & Niiranen 2005, 154, 165.) Yleisimpiä nestekromatografian detektoreita ovat taitekerroin-, UV/Vis- ja flueresenssidetektorit, massaspektrometri sekä ionikromatografiaan soveltuva johtokykydetektori (Jaarinen & Niiranen 2005, 165). Johtokykydetektori koostuu elektrodeista, joiden välissä on sähkökenttä. Liikkuva faasi kulkee elektrodien välistä, ja detektori mittaa ionien liikkuvuuden perusteella liuoksen sähkönjohtokyvyn. (Jaarinen & Niiranen 2005, 168.) Kuviossa 11 on esitelty sähkökemiallinen detektori.

14 KUVIO 11. Sähkökemiallinen detektori (Jaarinen & Niiranen 2005, 168) Detektorin hyviä ominaisuuksia ovat herkkyys (signaalin voimakkuus yhdisteen konsentraatio- tai massayksikköä kohden), vähäinen taustakohina sekä laaja lineaarinen alue (signaali on verrannollinen ainemäärään). Tämän lisäksi ominaisuuksiltaan hyvä detektori ei aiheuta piikkien levenemistä, ei reagoi lämpötilan tai liikkuvan faasin virtauksen muutoksiin, käyttäytyy samalla tavalla kaikkien eluenttien kanssa, reagoi nopeasti kaikkien näytekomponenttien kohdalla sekä antaa näytekomponenteista kvalitatiivista tietoa. (Franzen 2005, 21, 37.) Supressori on laite, joka on sijoitettu kolonnin ja detektorin välille. Laitteen pääasiallinen tehtävä on parantaa eluentin ja liuoksen havaitsemista detektorilla. Supressorin jatkuvan toiminnan kannalta regenerointiliuoksen käyttäminen on välttämätöntä. (Haddad & Jackson 2003, 26; Schäfer ym. 24.) Vaikka supressorilla onkin positiivinen vaikutus analytiikkaan, sen käyttö ei kuitenkaan ole aina välttämätöntä. Supressorilla saavutettavia etuja ovat mm. erot kolonnien kapasiteeteissa sekä erikoisten eluenttien käyttämisessä. Nämä asiat ovat olennaisia ainoastaan johtokyvyn havaitsemisessa. (Haddad & Jackson 2003, 26.) Eluentti on liikkuva faasi, joka koostuu yleensä vähintään kahdesta komponentista. Jotta näytteen sisältämät komponentit saataisiin eroteltua toisistaan, sopivat analysointiolosuhteet

15 etsitään muuttamalla eluentin sisältämien komponenttien välisiä suhteita. (Jaarinen & Niiranen 2005, 160; Riekkola 1995, 3.) Eluentin tärkeitä ominaisuuksia ovat: yhteensopivuus detektorin kanssa kilpailevan ionin laatu kilpailevan ionin pitoisuus eluentin ph puskurointikapasiteetti kompleksoitumiskyky orgaanisen modifoijan pitoisuus/määrä. (Haddad & Jackson 2003, 79.) Nestekromatografisia eluentteja on esitetty taulukossa 1. TAULUKKO 1. Nestekromatografisia eluentteja ja niiden poolisuusindeksit (Jaarinen & Niiranen 2005, 162.) Eluentti Poolisuusindeksi Heksaani 0 Heptaani 0 Dikloorimetaani 3,4 Dikloorietaani 3,7 Tetrahydrofuraani 4,2 Trikloorimetaani 4,3 Etyyliasetaatti 4,3 Isopropanoli 4,3 Dioksaani 4,8 Etanoli 5,2 Asetoni 5,4 Asetonitriili 6,2 Metanoli 6,6 Vesi 9,0 Hapollisia eluentteja käytetään erottamaan heikkoja happoja (esim. karboksyylihappoja) ja ehkäisemään niiden ionisointumista sekä antamaan terävyyttä kromatogrammin piikkeihin. Toisaalta myös vesi on yleensä sopiva eluentti todella heikoille hapoille. (Fritz & Gjerde 2000, 167.) Kompleksisia liuoksia käsiteltäessä ja vahvempia eluentteja käytettäessä ero-

16 tuksen nopeuttamiseksi retentioajat saattavat lyhentyä, jolloin eluoituvien komponenttien erotuskyky huononee. Ongelma voidaan kuitenkin ratkaista gradientin avulla, jolloin komponenttien erotukseen voidaan vaikuttaa esimerkiksi eluentin ph:n ja lämpötilan avulla. Menetelmä kuitenkin monimutkaistuu gradientin läsnäollessa ja ongelmia saattaa ilmaantua mm. detektorin kanssa. (Small 1989, 186 187.) 3.5 Kromatogrammin tulkinta Kromatogrammi kahdesta eri komponentista on esitetty kuviossa 12. Kyseinen kromatogrammi sisältää kolme piikkiä, joista ensimmäinen on injektiopiikki, ja sitä seuraavat kaksi ovat tutkittavien komponenttien piikit. (Haddad & Jackson 2003, 4.) Injektiopiikki sisältää liuottimen ja siihen liuenneen tutkittavan näytteen. Kuvaajassa t 0 tarkoittaa kuollutta aikaa, joka vastaa liikkuvan faasin käyttämää aikaa kulkiessaan kolonnin läpi. Retentioaika, t R kertoo yhden komponentin erottumiseen käytetyn ajan. (Schäfer ym. 4.) Teknologiakeskuksen KETEK Oy:llä käytössä olevan ionikromatografialaitteiston ohjelmisto laskee kyseiset suureet automaattisesti. KUVIO 12. Kromatogrammi kahdesta komponentista (Schäfer ym. 4.)

17 3.6 Komponenttien erotukseen vaikuttavat tekijät Ionikromatografian tavoitteena on erottaa näytteen komponentit mahdollisimman hyvin ja nopeasti. Erotukseen voidaan vaikuttaa muokkaamalla mm. hartsin rakennetta ja kapasiteettia, kolonnin halkaisijaa sekä eluentin tehokkuutta ja pitoisuutta. Erotukseen voidaan vaikuttaa myös orgaanisten liuottimien ja isokraattisen eluoinnin tai gradienttieluoinnin avulla. (Fritz & Gjerde 2000, 104.) Hartsin rakenteeseen ja kapasiteettiin liittyen kemiallisen koostumuksen muutokset voivat vaikuttaa selektiivisyyteen. Esimerkiksi kvaternäärisenä ammoniumjohdannaisena tavallisten metyyliryhmien sijaan etanoliamiiniryhmä lisää OH - -ionien ioninvaihtoaffiniteettia sekä vahvistaa NaOH:n ja KOH:n tehoa eluenttina. Lisäksi matalampi ioninvaihtokapasiteetti saa aikaan ionien nopeamman eluoinnin sekä sallii eluoinnin eluentin matalalla anionipitoisuudella. Eluointinopeuteen voidaan vaikuttaa myös kolonnin halkaisijaa muuttamalla. Eluointi tapahtuu sitä nopeammin, mitä pienempi halkaisija on, edellyttäen kuitenkin, että virtausnopeus pysyy samana. (Fritz & Gjerde 2000, 104.) Vaikutettaessa komponenttien erotustehokkuuteen eluentin tehokkuutta muokkaamalla on tarpeen huomioida mm. anionieluenttien tehokkuuden voimakas vaihtelu. Vahvemmin varautuneilla anioneilla, kuten karbonaateilla, on parempi erotustehokkuus kuin eluentin yksiarvoisilla anioneilla. Mikäli erotukseen halutaan vaikuttaa eluentin pitoisuutta muuttamalla, tällöin komponenttien rententioaikoja voidaan lyhentää käyttämällä väkevämpää eluenttia. (Fritz & Gjerde 2000, 104.) Orgaanisten liuottimien vaikutus komponenttien erotustehokkuuteen perustuu näytteen sisältämien komponenttien liukoisuuteen. Liukoisuutta voidaan parantaa lisäämällä liikkuvaan faasiin metanolia tai asetonitriiliä. Orgaaniset liuottimet parantavat myös näytteen sisältämien ionien sekoittuvuutta ioninvaihtohartsiin, sekä niiden avulla voidaan vähentää polarisoituvien anionien kromatogrammissa ilmenevää nk. häntimistä (engl. tailing). Mm. komponenttien liian suuret pitoisuudet voivat aiheuttaa kyseisen ilmiön. (Fritz & Gjerde 2000, 104.) Mikäli komponenttien erotukseen vaikutetaan isokraattisen eluoinnin tai gradienttieluoinnin avulla, tällöin yksinkertaisin menetelmä on suorittaa kokeet käyttäen määrättyä eluenttia

18 isokraattisissa olosuhteissa. Gradientin käyttäminen on suositeltavaa tai jopa välttämätöntä, mikäli näyte on erittäin monimutkainen tai retentioajoissa on suuret erot ensimmäisenä ja viimeisenä erottuvien komponenttien välillä. Gradientin käyttäminen on kuitenkin monimutkaista ja aiheuttaa lisää työtä analysoinnissa. (Fritz & Gjerde 2000, 104.)

19 4 IONIKROMATOGRAFISIA MENETELMIÄ Tässä luvussa on esitelty opinnäytetyön kannalta oleellisimpia analyyttisiä menetelmiä, joita on soveltuvin osin testattu laboratoriossa suoritetussa työn kokeellisessa osuudessa. Vaihtoehtoisia menetelmiä etsittäessä on kiinnitetty huomiota erityisesti ionikromatografisiin analyysimenetelmiin, joissa on käsitelty betaiinin, koliinikloridin, koboltin ja reniumin kvalitatiivista analysointia. 4.1 Betaiinin, koliinin ja trimetyyliamiinin määritys Zhangin ja Zhun vuonna 2007 julkaistussa tutkimuksessa Determination of betaine, choline and trimethylamine in feed additive by ion-exchange liquid chromatography/nonsuppressed conductivity detection on määritetty ioninvaihtonestekromatografialla betaiinin, koliinin ja trimetyyliamiinin (TMA) pitoisuuksia lisäainesyötteessä. Tämän lisäksi tutkimuksen pääpaino on ollut erotukseen vaikuttavien kromatografisten muutoksien selvittelyssä. Tutkimuksen mukaan yleiset epäorgaaniset kationit saadaan eroteltua ja käytetyn menetelmän voidaan todeta soveltuvan hyvin lisäaineiden laadun tutkimiseen. (Zhang & Zhu 2007, 114.) Zhangin ja Zhun tutkimuksessa näytteet valmistettiin liuottamalla betaiinihydrokloridi ja koliinikloridi eluenttiliuokseen. Liuokset suodatettiin ennen injektointia. Kromatografiset analysoinnit tehtiin ICS-2000 -nestekromatografialaitteistolla. Suojakolonnin lisäksi käytettiin myös analyyttistä kolonnia IonPac SCS1 (250 mm x 4 mm), joka soveltuu hyvin yleisten epäorgaanisten kationeiden ja eräiden amiinien analysoimiseen. Optimoitu eluenttiliuos sisälsi pitoisuudeltaan 4,5 mm olevaa metaanisulfonihappoa (MSA) ja 10-prosenttista asetonitriiliä. Erotus tapahtui isokraattisissa olosuhteissa, jolloin eluentti pysyi muuttumattomana koko kokeen ajan. Syöttönopeus oli 1 ml/min ja lämpötila 25 C. (Zhang & Zhu 2007, 115.) Tässä tapauksessa tutkimuksessa MSA valittiin eluentin hapoksi sen kohtuullisen matalan sähkönjohtokyvyn vuoksi. MSA-konsentraatiot tutkittiin välillä 3,6 5,4 mm, koska MSA:lle haluttiin määrittää optimaalinen konsentraatio asetonitriilipitoisuuden pysyessä

20 muuttumattomana (10-prosenttinen). Tulosten perusteella MSA:n optimaaliseksi konsentraatioksi valittiin 4,5 mm. (Zhang & Zhu 2007, 115.) Eluentin asetonitriilikonsentraatio testattiin välillä 5 15 %, kun aiemmin valittu MSAkonsentraatio (4,5 mm) pysyi muuttumattomana. Tulosten perusteella asetonitriilin konsentraatioksi valittiin 10 prosenttia. (Zhang & Zhu 2007, 115.) Zhangin ja Zhun tutkimuksessa esitellyssä HPLC-erotusmenetelmässä oli havaittavissa kaksi orgaanisten kationeiden erotuksessa ilmenevää mekanismia. Näitä mekanismeja olivat ioninvaihto sekä hydrofobinen vuorovaikutus näytteen kationeiden ja hartsimatriisin välillä. Zhangin ja Zhun tutkimustuloksissa myös suoritettujen analyysien välillä havaittiin selvä lineaarisuus konsentraatioiden ja piikkien pinta-alojen suhteen. (Zhang & Zhu 2007, 114 116.) Betaiinin, koliinikloridin ja TMA:n konsentraatioiksi saatiin 0,076, 0,044 ja 0,041 mg/l. Tutkittavan näytteen ja lisättyjen komponenttien (betaiini, koliinikloridi ja TMA) saanto oli 93 113 %. Analysointiaika oli alle 17 min. (Zhang & Zhu 2007, 114 116.) Tutkitun lisäaineen kromatogrammi näkyy kuviossa 13. Kuvaajasta voidaan erottaa hyvin mm. koliinikloridin ja betaiinin piikit. KUVIO 13. Lisäainesyötteen kromatogrammi. Piikit: (1) natrium, (2) betaiini, (3) kalium, (4) kalsium, (5) TMA, (6) koliinikloridi (Zhang & Zhu 2007, 116.)

21 4.2 Ilmakehän raskasmetallien analysointi ionikromatografialla Brunon, Casellin, Gennaron, Ielpon ja Trainin vuonna 2000 julkaistussa artikkelissa Analysis of heavy metals in atmospheric particulate by ion chromatography on esitetty tutkimustulokset ilmakehän raskasmetallipitoisuuksista, jotka on määritetty isokraattisissa olosuhteissa ionikromatografiaa käyttäen. Tutkimuksen näytteet olivat peräisin tehdasalueen sekä kaupungin ilmasta. Tutkittavia metalleja olivat Cu, Ni, Zn, Co, Fe 2+, Fe 3+, Cd ja Pb. Tutkimus suoritettiin käyttämällä kahta eri eluenttia. (Bruno & Caselli & Gennaro & Ielpo & Traini 2000, 145.) Artikkelin (Bruno ym. 2000) mukaan tutkimus suoritettiin Dionex 4500i - ionikromatografialaitteistolla. Analyyttisenä kolonnina käytettiin IonPac CS5A -kolonnia (250 x 4 mm), suojakolonnina IonPac CG5A -kolonnia (50 x 4 mm) sekä jälkikolonnina PC10 -kolonnia. IonPac CS5A -kolonni soveltuu sekä anioneiden että kationeiden erottamiseen samanaikaisesti. Injektiosilmukan koko oli 200 µl. Työssä käytettiin Vis-detektoria, jonka aallonpituudeksi oli asetettu 530 µm. Eluenttina oli natriumnitraatin (250 mm) ja oksaalihapon (28 mm) seos. Jälkikolonnin reagenssina käytettiin resorisinolin (0,12 mg/l) ja ammoniumhydroksidin (3M) seosta. Eluentin ja jälkikolonnin reagenssin virtausnopeuksiksi oli asetettu 1 ml/min ja 0,6 ml/min. (Bruno ym. 2000, 146 147.) Tutkimuksessa ennen analysointia suoritettava näytteenkäsittely oli erittäin tärkeää. Tässä tapauksessa pääasiassa nitraattimuodossa olevat metallit liuotettiin 10 ml:n liuokseen, joka koostui natriumkloridista, natriumnitraatista ja oksaalihaposta. Näyte suodatettiin Autotop WF Plus 0,4 µm -polykarbonaattisuodattimella. Merkittävä parannus tuloksiin saatiin myös poistamalla eluentista kloridi (50 mm) ja lisäämällä se näytteeseen, jolloin kromatogrammin piikit kasvoivat huomattavasti. (Bruno ym. 2000, 147 148.) Kromatogrammi on esitetty kuviossa 14.

22 KUVIO 14. Kromatogrammi raskasmetalleista (Bruno ym. 2000, 148.) Optimaaliset analysointiolosuhteet saatiin määritettyä, kun eluentti valmistettiin yhdistämällä 28 mm oksaalihappoa ja 250 mm natriumnitraattia ja näytteeseen lisättiin 28 mm oksaalihappoa, 120 mm natriumnitraattia sekä 50 mm natriumkloridia. (Bruno ym. 2000, 147 148.) Tutkimuksen tulokset on esitetty taulukossa 2. TAULUKKO 2. Tehdas- ja kaupunkialueen metallipäästöt (mukaillen Bruno ym. 2000, 150.) Metallit Näytteenottopaikka ja päivämäärä Tehdasalue Kaupunkialue Rione Rione Tamburi Tamburi (9/29/99) a (10/1/99) b Corso Cavour (2/20/99) a Corso Cavour Via Amnedola (10/20/99) b (2/22/99) a Pb 0,1±0,2 0,25±0,02 0,30±0,08 0,40±0,08 0,280±0,040 Fe 1,80±0,10 2,42±0,006 0,80±0,06 0,91±0,07 0,750±0,030 Cu 0,33±0,07 0,30±0,04 0,33±0,07 0,46±0,08 0,310±0,030 Co 0,10±0,03 0,12±0,03 <0,01 <0,01 <0,005 Cd <0,02 <0,01 <0,02 <0,02 <0,010 Ni 0,30±0,09 0,25±0,06 0,03±0,01 0,02±0,01,020±0,005 Mn 0,70±0,05 1,70±0,05 0,03±0,01 0,05±0,02 0,032±0,006 Zn 0,30±0,10 0,60±0,10 0,30±0,10 0,50±0,10 0,500±0,050 a Näytteenottoaika = 24 h b Näytteenottoaika = 48 h Tutkimuksen mukaan ilmaston raskas- ja siirtymämetallit voidaan erottaa ja määrittää isokraattisissa olosuhteissa ionikromatografialla. Menetelmä soveltuu erittäin hyvin kaiken-

23 tyyppisiin ionikromatografisiin analyyseihin, joissa näyte on käsiteltävä hapon läsnäollessa. (Bruno ym. 2000, 149 150.) 4.3 Yleisten kationeiden ja eräiden siirtymämetallien tutkiminen ionikromatografialla Zengin, Chenin, Cuin, Wun, Zhun ja Fritzin vuonna 2006 tekemässä tutkimuksessa Single-column method of ion chromatography for the determination of common cations and some transition metals oli tarkoituksena määrittää yleisten kationeiden ja eräiden siirtymämetallien pitoisuudet olutnäytteissä ja pullotetuissa mineraalivesinäytteissä ionikromatografiaa käyttäen. Tutkittavia olutnäytteitä oli neljä ja mineraalivesiä kaksi. Määritettäviä komponentteja olivat kupari, litium, natrium, ammoniakki, kalium, koboltti, nikkeli, magnesium, kalsium, strontium ja sinkki. (Zeng & Chen & Cui & Wu & Zhu & Fritz 2006, 68.) Siirtymämetalleja näistä ovat kupari, sinkki, nikkeli ja koboltti (Zeng ym. 2006, 71). Analysoinnit suoritettiin ICS-2000-ionikromatografialaitteistolla. Laite oli varustettu isokraattisella pumpulla, sähkönjohtokykydetektorilla ja kolonnin lämmittimellä. Laite ei sisältänyt supressoria. Analyyttisen kationinvaihtokolonnin IonPac SCS1 (250 mm x 4 mm) lisäksi käytettiin myös suojakolonnia IonPac SCG1 (50 mm x 4 mm). Injektiosilmukan koko oli 25 µl. Tutkimustulosten perusteella optimaalinen eluentti koostui MSA:sta (2,5 mm) ja oksaalihaposta (0,8 mm). Eluentin virtausnopeus oli 1 ml/min. (Zeng ym. 2006, 69.) Kaikkien liuosten käsittelemiseen käytettiin deionisoitua vettä. Noin 4 ml näytteitä A ja B (olutnäytteet) lisättiin 100 ml:n astioihin ja astiat täytettiin deionisoidulla vedellä. Pullotettu mineraalivesi injektoitiin ilman laimennusta. Näytteet suodatettiin membraanisuodattimella ennen injektointia. (Zeng ym. 2006, 71.) Tutkimuksen tulosten (Zeng ym. 2006) perusteella retentioajan huomattiin laskevan, kun oksaalihapon konsentraatiota nostettiin. Sinkki ja kupari eivät erottuneet toisistaan oksaalihapon pitoisuuden ollessa 0,6 mm. Pitoisuuden ollessa > 1 mm ongelmia aiheutui kuparin piikin muodostumisessa. Oksaalihapon optimaaliseksi pitoisuudeksi määritettiin 0,8 mm. Tutkittavien näytteiden ja lisättyjen komponenttien saanto oli 95 106 %. Käytetty tekniikka antoi tyydyttävät tulokset määritettäessä kationeita ja siirtymämetalleja olut- ja mineraali-

24 vesinäytteistä. (Zeng ym. 2006, 70 71.) Taulukossa 3 on esitetty näytteistä analysoidut metallipitoisuudet. TAULUKKO 3. Metallien määritys mineraalivesi- ja olutnäytteistä (Zeng ym. 2006, 71.) Pitoisuudet näytteissä (mg l -1 ) Komponentti Mineraalivesi Mineraalivesi Olut B b Olut C b Olut D b A B Cu 2+ <DL <DL <DL <DL <DL Li + 0,041 0,020 <DL 0,010 <DL Na + 62,14 70,30 2,32 2,28 3,58 NH 4 + <DL <DL 0,120 2,28 3,58 K + 29,19 32,88 10,33 11,23 9,86 Ni 2+ <DL <DL <DL <DL <DL Zn 2+ <DL <DL 0,09 0,04 0,06 Co 2+ <DL <DL <DL <DL <DL Mg 2+ 12,79 13,63 2,57 2,64 2,55 Ca 2+ 41,44 42,72 1,20 1,31 1,14 Sr 2+ 0,52 0,37 <DL 0,31 <DL a Toteamisraja, DL (engl. detection limit) b 25-kertainen laimennus 4.4 Epäorgaanisten anionien ja metalli-ionien samanaikainen määritys Concetta Bruzzonitin, Mentastin ja Sarzaninin vuonna 1998 julkaistussa tutkimuksessa Simultaneous determination of inorganic anions and metal ions by suppressed ion chromatography on määritetty samanaikaisesti epäorgaaniset anionit sekä metalli-ionit järvestä otetusta näytteestä ionikromatografiaa käyttäen. Näytteistä tutkittavat yhdisteet valittiin ympäristöllisistä syistä. Tutkittavat anionit olivat BrO - 3, SeO 2-3, SeO 2-4, HAsO 2-4, WO 2-4, MoO 2-4, CrO 2-4 ja metallit Pb 2+, Cd 2+, Ni 2+ ja Cu 2+. Tutkimuksessa määriteltiin pitoisuuden lisäksi myös sopiva ph eluentille, mikä paransi yhdisteiden erotusta. (Concetta Bruzzonitti & Mentasti & Sazanini 1999, 291.)

25 Tutkimus (Concetta Bruzzonitti ym. 1999) suoritettiin ionikromatografialaitteistolla, jossa käytettiin suojakolonnina Dionex AG9 -kolonnia (4 x 50 mm) ja erotuskolonnina Dionex AS9 -kolonnia (4 x 250 mm). Kolonnin hartsit koostuivat 15 µm:n kokoisista polystyreenidivinyylibentseenisubstraatti-agglomeraatteista. Tutkimuksen tulosten perusteella sopivaksi eluentiksi valittiin pitoisuudeltaan 3,5 mm oleva NaHCO 3 ja sen optimaaliseksi ph-arvoksi todettiin 9,75. Kyseistä eluenttia käyttäen määritettiin näytteistä Pb 2+, Cd 2+, Ni 2+, Cu 2+, SeO 2-3, SeO 2-4 ja HAsO 2-4. Tutkimuksessa käytettiin myös eluentin ph-arvoa 10,5, jonka avulla määriteltiin loput yhdisteet: WO 2-2- 4, MoO 4 ja CrO 2-4. (Concetta Bruzzonitti ym.1999, 293 297.) Gradienttien käyttäminen oli analysoinnissa välttämätöntä, koska eluointi ei ollut mahdollista isokraattisissa olosuhteissa. Eluenttiin lisättiin etyleenidiamiinitetraetikkahappoa (ED- TA) sen erinomaisten kelatointiominaisuuksien vuoksi. Ennen injektointia näytteet suodatettiin 3 µm- ja 0,22 µm -suodattimilla sekä käsiteltiin OnGuard-RP -panoksella, jotta kromatografista analysointia häiritsevät orgaaniset yhdisteet saatiin eroteltua. Näytteet jaettiin kahteen osaan. Toinen osa ajettiin EDTA:n kanssa ja toinen ilman. (Concetta Bruzzonitti ym. 1999, 293 297.) Tutkimuksen tulosten perusteella ionikromatografian todettiin olevan varteenotettava analyyttinen erotusmenetelmä epäorgaanisten anionien ja metalli-ionien samanaikaisessa määrityksessä. Menetelmän etuja ovat mm. esikäsittelyn vähäinen ajankulutus sekä esiväkevöintiyksikkö (engl. preconcentration manifold). (Concetta Bruzzonitti ym. 1999, 297 298.) 4.5 Yleisten epäorgaanisten anionien ja kationien määritys Aminin, Wah Limin ja Takeuchin (2008) tutkimuksessa Determination of common inorganic anions and cations by non-suppressed ion chromatography with column switching on pyritty määrittämään seitsemän epäorgaanista anionia ja viisi epäorgaanista kationia jokivedestä otetuista vesinäytteistä. Tutkittavia anioneita olivat F, H 2 PO 4, NO 2, Cl, Br, NO 3, SO 2-4 ja kationeita Na +, NH + 4, K +, Mg 2+, Ca 2+. (Amin & Wah Lim & Takeuchi 2008.)

26 Tutkimus suoritettiin yhdellä pumpulla, eluentilla ja detektorilla. Kolonneina käytettiin 10- porttisen venttiilin avulla sarjaan kytkettyä TSK gel -Super-IC-Cation -kolonnia (150 x 4,6 mm) ja TSK gel -IC-Anion-PWXL -kolonnia (50 x 4,6 mm). Eluenttina oli pitoisuudeltaan 1 mm oleva trimelliittihappo, jonka ph-arvo oli 2,9. Virtausnopeudeksi oli säädetty 0,7 ml/min. Tutkimus suoritettiin isokraattisissa olosuhteissa. (Amin ym. 2008.) Standardiliuokset oli valmistettu käyttämällä deionisoitua vettä. Näytteet käsiteltiin 0,45 µm:n membraanisuodattimella ja jäähdytettiin 4 C:een lämpötilaan polyetyleeniastioissa. Näytteet injektoitiin ilman laimennusta. Tutkimustuloksessa huomattiin anionien erottuvan kationeita nopeammin (Amin ym. 2008). Työn tuloksien perusteella viisi yleistä epäorgaanista kationia kyettiin erottamaan hyvin 35 minuutissa. Myös anionit saatiin erotettua hyvin, mutta tuolloin eluentin ph:n muokkaamiseen oli kiinnitettävä erityisesti huomiota. (Amin ym. 2008.) Tutkimuksen tulokset on esitetty taulukossa 4. Näytteen fluoridipitoisuutta ei taulukossa ole, koska pitoisuus oli toteamisrajaa matalampi. TAULUKKO 4. Anionien ja kationien määritys vesinäytteestä (Amin ym. 2008.) Komponentit Ijira-vesinäyte Kationit mm ppm RSD (%) Na + 0,329 7,9 2,14 NH 4 + 0,041 0,7 1,98 K + 0,072 2,9 1,43 Mg 2+ 1,26 3,0 2,12 Ca 2+ 0,210 8,4 1,94 Anionit F - ND ND - H 2 PO 4 - /HPO 4 2-0,008 0,8 2,81 No 2-0,006 0,3 2,45 Cl - 0,160 5,7 1,87 Br - 0,005 0,4 2,66 NO 3 - SO 4 2-0,094 5,8 1,38 0,067 6,4 1,65 ND = alle toteamisrajan (engl. not detected)

27 Tutkimuksessa käytetyn menetelmän todettiin olevan helppo ja yksinkertainen käytettäväksi vesinäytteiden sisältämien epäorgaanisten anionien ja kationien määrittämiseksi. pitoisuudeltaan 1 mm olevan trimelliittihapon (ph 2,94) todettiin soveltuvan hyvin edellä esiteltyjen anionien ja kationien määritykseen. (Amin ym. 2008.) 4.6 Menetelmä betaiinin ja N,N-dimetyyliglysiinin määrittämiseen verestä ja virtsasta Laryean, Steinhagenin, Pawliczekin ja Wendelin vuonna 1998 julkaistussa artikkelissa Simple method for the routine determination of betaine and N,N-dimethylglycine in blood and urine käsitellään nopealla ja yksinkertaisella menetelmällä suoritettua betaiinipitoisuuden määrittämistä veri- ja virtsanäytteistä. (Laryea & Steinhagen & Pawliczek & Wendel 1998, 1937.) Verinäytteet oli otettu viideltä sairaalta lapselta ja 12 terveeltä vapaaehtoiselta keskiikäiseltä aikuiselta. Näytteet laitettiin EDTA:ta sisältäneisiin mittapulloihin. Neljä sairasta lasta lääkittiin betaiiniannoksella, jonka pitoisuus oli 600 mg/kg päivittäin ja yhtä pitoisuudeltaan 200 mg/kg. (Laryea ym. 1998, 1938.) Betaiini ja N,N-dimetyyliglysiini (DMG) laimennettiin vedellä konsentraatioon 1 mm. Johdannaisliuos valmistettiin liuottamalla 66 mg 2,5 mmol:sta 1,4,7,10,13,16-heksaoksasyklooktadekaania ja 1390 mg (50 mmol) 4-bromofenasyylibromidia 100 ml:aan asetonitriiliä. Virtsanäytteet laimennettiin vedellä suhteeseen 1:10. Työssä oli käytetty HPLC-laitteistoa. Kolonniksi oli valittu Supelcosil TM LC-SCX (25 cm x 4,6 cm). (Laryea ym. 1998, 1938.) Liikkuvana faasina käytettiin asetonitriilin (900 ml/l) ja veden (100 ml/l) seosta, joka sisälsi 22 mm koliinia. Liikkuvasta faasista poistettiin mahdolliset ilmakuplat käsittelemällä näyte ultraäänihauteessa 30 min:n ajan. Eluentin virtausnopeutena käytettiin 1,5 ml/min. (Laryea ym. 1998, 1938.) Tutkimuksessa terveiden ihmisten veriplasman DMG- ja betaiinipitoisuuksiksi määritettiin 4 13 µm ja 20 144 µm. Betaiinia saaneiden potilaiden veriplasman DMG- ja betaiinipitoisuudet olivat 8 228 µm ja 20 2680 µm. Virtsanäytteiden betaiini- ja DMG-pitoisuudet olivat myös korkeammat lääkitystä saanneilla potilailla. (Laryea ym. 1998, 1940.)

28 Menetelmällä todettiin olevan etuja muihin julkaistuihin HPLC-määritelmiin nähden, koska suurinta osaa analytiikkaa häiritsevistä yhdisteistä ei tarvinnut poistaa ennen derivatisointia. Laryean ym. mukaan mielenkiintoista tutkimuksessa olivat betaiinipitoisuuksille saavutetut, muita samankaltaisia tutkimuksia (esim. Allen) vastaavat suuremmat arvoalueet. (Laryea ym. 1998, 1940 1941.) 4.7 Uusia strategioita siirtymämetallien määrittämiseen Cardellicchion, Cavallin, Ragonen ja Riviellon (1999) tekemässä tutkimuksessa New strategies for determination of transition metals by complexation ion-exchange chromatography and post column reaction on määritetty metallipitoisuuksia tiettyjen rannikkoalueiden merenpohjasedimenteistä. Tutkimuksessa analysoitavia metalleja olivat Cu, Ni, Zn, Co, Fe 2+, Fe 3+, Mn, Cd ja Pb. Tutkimuksessa esitellyt kaksi metallien määritysstrategiaa ovat seuraavat: 1) kahden eluentin optimointi, gradientin ja anioninvaihtoselektiivisyyden muokkaaminen. 2) uuden reagenssin 2-(5-bromo-2-pyridylazo)-5-dietyyliaminofenoli (5-Br-PADAP) käyttäminen jälkikolonnissa metallien selektiivisyyden parantamiseksi ja toteamisrajan pienentämiseksi. (Cardellicchio ym. 1999, 251 252.) Tutkimus (Cardellicchio ym. 1999) suoritettiin Dionex 4500i HPLC - ionikromatografialaitteistolla, joka sisälsi yhden gradienttipumpun, VDM-2-detektorin, Rheodyne 9126 -injektorin, IonPac CS5A -analyyttisen kolonnin (250 x 4 mm) ja IonPac CG5A -suojakolonnin (50 x 4 mm). Kolonneista poistettiin happea pumppaamalla niiden läpi natriumsulfaattia (0,1 M) yhden tunnin ajan. Kaikki näytteet käsiteltiin 0,45 µm - suodattimella lukuunottamatta jälkikolonnin reagensseja 4-(2-pyridylazo)resorisinolia (PAR) ja 5-Br-PADAP:a, jotka käsiteltiin 0,2 µm -suodattimella. Injektoinnissa käytettiin 750 µl:n näytesilmukkaa. Eluentit puhdistettiin typellä 20 min:n ajan ennen käyttöä raudan hapettumisen estämiseksi. (Cardellicchio ym. 1999, 252 254.) Parhaimmat ionikromatografiset olosuhteet on esitetty taulukossa 5.

29 TAULUKKO 5. Ionikromatografiset olosuhteet (Cardellicchio ym. 1999, 253.) PDCA Gradientit Kolonnit IonPac CG5A + IonPac CG5A + CS5A CS5A Eluentit A B 7 mm PDCA 66 mm KOH 5,6 mm K 2 SO 4 74 mm HCOOH 28 mm Oksaalihappo 45 mm NaCl 116 mm NaNO 3 40 mm HCl 28 mm oksaalihappo 45 mm NaCl 265 mm NaNO 3 40 mm HCl Gradienttiohjelma - Aika %A %B 0 100 0 9 0 100 Virtausnopeus 1,0 1,0 (ml/min) Injektiotilavuus 750 750 (µl) PAR 5BR.PADAP Jälkikolonnin reagenssi 0,4 mm PAR 1 M 2- dimetyyliaminoetanoli 0,5M NH 4 OH 0,3 mm 5Br-PADAP 0,8 % Triton X-100 0,5 M NH 4 OH 0,3 M NaHCO 3 (ph 10,5) 0,3 M NaHCO 3 (ph 10,4) Virtausnopeus 0,6 0,6 (ml/min) Detektori Vis 530 nm Vis 560 nm Tutkimuksessa (Cardellicchio ym. 1999) esiteltiin eluenttien uusia koostumuksia perustuen oksaali- ja suolahappoihin. Kromatografisella menetelmällä voitiin yhdellä ajolla määrittää yhdeksän eri metallia. Jälkikolonnin reagenssin valitseminen oli ratkaisevan tärkeää piikkien muotojen parantamiseksi. (Cardellicchio ym. 1999, 254 255.) Tutkittaessa siirtymämetalleja spektrofotometrisesti PAR on käytetyin reagenssi. Vähitellen 5-Br-PADAP:n käyttö on kuitenkin yleistynyt, koska kyseinen kemikaali muodostaa stabiileja metallikomplekseja metalli-ionien kanssa. Cardellicchion ym. tutkimuksessa esiteltyä menetelmää käyttäen kyetään erottamaan toisistaan Fe 2+ ja Fe 3+, mikä on erityisen tärkeää

30 tutkittaessa hapetus-pelkistysprosesseja veden ja pohjasedimentin yhtymäkohdassa. (Cardellicchio ym. 1999, 254 255.) Tutkimustulosten (Cardellicchio ym. 1999) mukaan pohjasedimentistä mitatut metallipitoisuudet vastasivat virallisia arvoja. Käytetyt eluentit mahdollistivat hyvät kromatografiset erotukset tutkittaville metalleille. 5-Br-BADAP:n käyttäminen jälkikolonnin reagenssina aiheutti liian suuria toteamisarvoja lyijylle. Menetelmää voitaisiin kuitenkin kehittää etsimällä jälkikolonnille uusi reagenssi, joka parantaisi pääasiassa raskasmetallien herkkyyttä. Menetelmän todettiin olevan erittäin tehokas analysoitaessa epävakaita, heikosti kompleksoituvia metalleja merenpohjan sedimenteistä sekä alentavan kontaminaatioriskejä. (Cardellicchio ym. 1999, 257 258.) 4.8 Ionivahvuuden, ph:n ja lämpötilan vaikutukset siirtymä- ja raskasmetalliioneiden selektiivisyyteen Bashirin ja Paullin vuonna 2001 julkaistussa tutkimuksessa Ionic strenght, ph and temperature effects upon selectivity for transition and heavy metal ions when using chelation ion chromatography with an iminodiacetic acid bonded silica gel column and simple inorganic eluents on tutkittu siirtymä- ja raskasmetalli-ionien selektiivisyyttä käytettäessä iminodiasetaattihapolla (IDA) modifioitua silikageelikolonnia sekä ei-kelatoivia epäorgaanisia eluentteja. Tutkimuksessa käytettiin useita eluenttiparametreja (eluentin ionivahvuus, ph, lämpötila sekä käytetyn epäorgaanisen suolan luonne) tarkan retentiomekanismin määrittämiseksi ja selektiivisyyden kontrolloimiseksi. Metalli-ioninen määrittäminen suoritettiin makeanveden referenssinäytteestä. Analysoitavia metalli-ioneja olivat: Mg 2+, Ca 2+, Mn 2+, Cd 2+, Co 2+, Zn 2+ ja Pb 2+. (Bashir & Paull 2001, 73.) Tutkimuksessa (Bashir & Paull 2001) käytettiin IDA-silikatäytteistä analyyttistä kolonnia (partikkelikoko: 8 µm, huokosjakauma: 130 Å, mitat: 250 x 4 mm), 250 µl injektiotilavuutta ja SPD-6AV UV-Vis -detektoria (aallonpituus: 495 nm). Eluentin virtausnopeus oli 1,5 ml/min. Analysointi suoritettiin isokraattisissa olosuhteissa. Käytetty eluentti koostui kaliumnitraatista (0,065 M) ja kaliumkloridista (0,035 M). Eluentin ph oli säädetty arvoon 2,5 laimennetun typpihapon avulla. Jälkikolonnin reagenssina käytettiin ammoniakin (0,5 M) ja 4-(2-pyridylazo)resorisinolin (0,4 mm) seosta, jonka ph-arvo oli 10,5. Kaikki liuok-