Liuosten valmistus, puskuriliuokset ja ph

Liuosten valmistus, puskuriliuokset ja ph 740151P Biokemian menetelmät I BMTK / Juha Kerätär Päivän aiheet Mihin puskuriliuoksia tarvitaan biokemiassa? Miten liuoksia valmistetaan? Mitä on sterilointi? Luennon oppimistavoitteet: Opiskelija ymmärtää miksi biokemian töissä käytetään puskuriliuoksia. Opiskelija tietää, miten valmistetaan biokemian laboratoriossa käytettäviä liuoksia, ja osaa soveltaa tietoa käytännön töissä. Opiskelija tietää ja osaa kertoa, mitä tarkoittaa steriilityöskentely ja miksi se on tärkeää biokemiallisissa töissä. 2 1

Mikä on solun yleisin molekyyli? Mikä on solun ph? Miksi elimistön ph:ta säädellään? 3 Vesi Kaikki elävät solut tarvitsevat vettä. Solun massasta 60-90% on vettä. Biologiset reaktiot tapahtuvat vesipohjaisessa ympäristössä. Rakenteestaan johtuen vesimolekyyli on polaarinen. NaCl-kide liukenee veteen Toiset polaariset ja ionisoituvat yhdisteet liukenevat siihen helposti eli ovat hydrofiilisia. Poolittomat (ei-polaariset) yhdisteet liukenevat veteen huonosti tai eivät ollenkaan eli ovat hydrofobisia. Biologiset yhdisteet sisältävät usein sekä hydrofiilisiä että hydrofobisia osia, eli ne ovat amfipaattisia molekyylejä. Polaariset vesimolekyylit muodostavat vetysidoksia. 4 2

ph ph kuvaa liuoksen happamuutta ja emäksisyyttä - Hapan aine: kykenee luovuttamaan protonin vesiliuoksessa, esim HCl. - Emäksinen aine: kykenee vastaanottamaan protonin vesiliuoksessa, esim. NaOH. ph-asteikko kuvaa liuoksen vapaiden vetyionien molaarista konsentraatiota [H + ] (joskus [H 3 O + ]) Asteikon perustana puhtaan veden ionisoituminen Neutraaliksi ph: tilanne, jossa ionisoituneiden vety- ja hydroksyyli-ionien konsentraatio on sama, [H + ] [OH - ] 10-7 M (25 C). ph -log 10 [H+]; esim. -log 10 (10-7 ) 7 ph-asteikko ei ole lineaarinen vaan logaritminen > Liuos, jonka ph on 3 on tuhat kertaa happamampi kuin liuos, jonka ph on 6. 5 ph:n mittaaminen Biokemian laboratoriossa ph:n määrittämiseen esimerkiksi liuoksia valmistaessa käytetään tyypillisesti phmittaria. H + -elektrodi mittaa jännite-eron mitattavassa nesteessä olevan elektrodin ja referenssinesteessä olevan elektrodin välillä ph Muistettava kalibroida ph-mittari säännöllisesti referenssinäytteillä, joiden ph tunnettu! ph:n ja sen muutosten määrittämiseen voidaan käyttää myös ph:n muutoksiin reagoivia väriaineita. ph-indikaattoripaperi tai -liuska ph-väriaineet (esimerkiksi fenolipunainen soluviljelymedian ph:n seurannassa) 6 3

Puskuriliuokset (buffer solutions) Puskuriliuoksen ph ei muutu, kun pieni määrä happoa tai emästä lisätään siihen Klassinen puskuriliuos valmistetaan heikosta haposta ja sitä vastaavasta emäksestä. Kun hapon ja emäksen konsentraatio on yhtä suuri, ph pka ja liuoksen puskurointikapasiteetti on suurimmillaan. pka happovakio, kuvaa hapon ionisoitumista ja sen kautta hapon vahvuutta Nyrkkisääntönä puskuri toimii parhaiten ph-alueella pka±1. Puskurin konsentraatio yleensä noin 10 mm 200 mm. Puskuriliuoksen ph voidaan laskea Henderson-Hasselbachin yhtälöstä: missä ph pka + lg [A ] [HA] pka käytetyn hapon happovakio [A - ] emäksen konsentraatio [HA] hapon konsentraatio 7 Yleisiä puskuriliuoksia Klassisia puskureita ovat esim. fosfaatti-, karbonaatti-, asetaatti- ja sitraattipuskurit. Valmistetaan aina heikosta haposta ja emäksestä. Tehdään tyypillisesti kirjallisuudesta löytyvän ohjeen tai taulukon mukaan. Toisiaan vastaavasta emäs- ja happoliuoksesta tehdään saman konsentraation liuokset, joita sekoitetaan tietyssä suhteessa, jotta saadaan haluttu ph Esimerkki: Valmistetaan 50 mm Na 2 HPO 4 ja 50 mm NaH 2 PO 4 liuokset. Sekoitetaan näitä ph-mittarin avulla ph:ta seuraten 18,75 ml ja 31,25 ml, kunnes on saatu aikaan ph 6,6 50 mm fosfaattipuskuriliuosta noin 50 ml. http://www.sigmaaldrich.com/life-science/corebioreagents/biological-buffers/learning-center/buffer-referencecenter.html 8 4

Fosfaattipuskurin valmistusohje 9 Yleisiä puskuriliuoksia Yleisten puskurien ph-alueita (Reed 2013). Monet perinteisten puskurien komponenteista (esim. fosfaatti, sitraatti) voivat vaikuttaa solujen aineenvaihduntaan. On kehitetty synteettisiä puskurimolekyylejä jotka soveltuvat erityisesti biokemiallisiin ja solubiologisiin kokeisiin. Tyypillisesti nämä ovat ns. zwitterionisia molekyylejä, eli niissä on sekä positiivisesti että negatiivisesti varautuneita ryhmiä. (Huomaa: myös proteiinit zwitterionisia!) Esim. TRIS, HEPES, MES, PIPES Käytetään valmistamalla oikean konsentraation liuos, ja phmittaria apuna käyttäen säätämällä sen ph halutuksi HCl- tai NaOH-liuoksella. Valmis puskuri merkitään esimerkiksi Tris- HCl, ph 7,8. Puskurin lämpötila voi vaikuttaa sen pharvoon! Säädä ph mielellään siinä lämpötilassa, jossa aiot puskuria käyttää. Etenkin Tris-puskuri on herkkä lämpötilan muutokselle. Samalla puskurilla ph 7,50 kun lämpötila 25 C, mutta 8,07 kun lämpötila 5 C 10 5

ph ja puskuriliuokset biokemiassa Casey et al. 2010 (Nature Reviews Molecular Biology) Biomolekyylit (esim. entsyymit) ja soluorganellit kokonaisuuksina toimivat elimistössä ja soluissa parhaiten tietyllä phalueella. Elimistön ph on tarkasti säädelty! Ihmisen veriplasman ph on 7,4, sitä ylläpitää bikarbonaattihiilihappo-puskurointi. Soluissa puskureina toimivat bicarbonaatin lisäksi proteiinit ja epäorgaaninen fosfaatti. Kun tehdään kokeita in vitro eli koeputkessa solumateriaalilla, solun ulkopuolisen nesteen ph:n tulisi olla mahdollisimman samanlainen kuin elimistössä käytetään puskuroituja liuoksia Sopiva puskuri vaihtelee tutkittavan kohteen (solu, tuma, mitokondrio, entsyymi) mukaan: Jos tiedetään kohteen optimaalinen ph-alue, käytetään puskuria jonka pka-arvo on mahdollisimman lähellä haluttua ph arvoa 11 Reagenssien punnitseminen Punnitsemiseen käytössä erilaisia vaakoja. Reagenssivaaka (käyttöalue 0,01 g 2 kg) Analyysivaaka (käyttöalue 0,0001 g 200 g) Varo punnitessa reagenssien kontaminoitumista. Käytä aina puhdasta spaattelia tai lusikkaa kun siirrät reagenssia purkista punnitusalustalle. Jokainen reagenssi punnitaan omalle, puhtaalle punnitusalustalle. Älä laita punnitusalustalta ylimääräistä reagenssia takaisin purkkiin reagenssit voivat olla kalliita, siirrä punnitusalustalle vain vähän kerrallaan! Jauhemaiset reagenssit voivat pölytä helposti jos punnitset jotain terveydelle vaarallista, käytä vetokaappia, hengityssuojainta tai kohdepoistoa. Siivoa jälkesi punnituksen jälkeen vaaka ja punnituspöytä! Ilmoita aina reagenssien loppumisesta. Älä koskaan vie tyhjää purkkia takaisin hyllyyn! Huomioi oikeat säilytyslämpötilat! 12 6

Vesi laboratoriokäytössä Laboratorioliuokset tehdään lähes aina erityispuhdistettuun veteen. Puhtaustaso käyttötarkoituksen mukaan (herkkä analyysimenetelmä ultrapuhdas vesi). Tislattu ja deionisoitu (ddh 2 O) tai Nanopure-suodatettu vesi tavallisin biokemian laboratoriossa. Tyypillisesti laboratoriossa erillisissä vesiastioissa. Dietyylipyrokarbonaatti-käsitelty (DEPC) vesi RNA-töissä, RNAasien inaktivoimiseen. Huom! DEPC hajoitetaan jälkikäteen autoklavoimalla Puhtausstandardeja useita https://en.wikipedia.org/wiki/purified_water#laboratory_u se 13 Liuosten valmistus ja säilytys Liuosten valmistus mittapulloon (volumetric flask) tai tilavuudeltaan sopivaan dekantterilasiin (erlenmeyerkolvin tilavuusasteikko ei ole riittävän tarkka).. Liuota liuoksen eri reagenssit veteen yksi kerrallaan voidaan tehdä dekantterissa tai mittalasissa, ja tasata tilavuus mittapullossa vasta lopuksi. Jotkin reagenssit saattavat liueta vain tietyssä ph:ssa seuraa liuoksen valmistusohjetta tarkasti. Liuoksen ph säätö: säädä ph Happo tai emäs lisätään veteen pienissä erissä Siirrä lopuksi mittapulloon ja säädä tilavuus tarkaksi. https://youtu.be/aousywhjoi4 14 7

Liuosten valmistus ja säilytys Mittalasit ja mittapullot eivät ole säilytysastioita! Valmistetut liuokset tulee siirtää uuteen pulloon, putkeen tai vastaavaan. Valmistetut liuokset tulee varustaa etiketillä, josta selviää: päiväys liuoksen nimi aineiden pitoisuudet mihin työhön käytetään tekijä (kurssilla esimerkiksi ryhmän numero) tarvittavat varoitusmerkinnät Epämääräisesti merkittyjä liuoksia ei saa jättää laboratorioon tai säilytystiloihin! Säilytä liuos oikeassa lämpötilassa (-20 C, +4 C). Tarkista viimeistään työtä edeltävänä päivänä, että tarvitsemiasi liuoksia on riittävästi. 15 Biokemian liuoslaskut M(NaCl) 58,44 g/mol V 0,5 l c 0,3 mol/l m? koska n m M ja c n V, m n M c V M 0, 3 mol 0, 5 l 58, 44 g l mol 8, 766 g Konsentraatio, molaarisuus c: yksikkönä mol/l M eli liuenneen aineen määrä mooleina / liuoksen tilavuus litroina. Liuoslaskuissa käytetään kaavoja: n m M ja c n V jossa n liuotettavan aineen määrä mooleissa (mol) m liuotettavan aineen massa grammoissa (g) M liuotettavan aineen molekyylipaino (g/mol) V liuoksen tilavuus litroissa Esimerkki: Miten valmistetaan 500 ml 0,3 M natriumkloridiliuosta, kun tiedetään että M(NaCl) 58,44 g/mol? Käytännössä: Punnitaan natriumkloridia 8,77 g. Liuotetaan dekassa tai mittapullossa alle 500 ml:aan H 2 O. Täytetään 500 ml mittapullossa merkkiin saakka. 16 8

Biokemian liuoslaskuja n 5 pmol 5 x 10-12 mol N 20 (bp) c 100 ng/µl V? m n M 5 10 mol 330 g mol 20 3,3 10 g 33 ng DNA:n, RNA:n ja proteiinien pitoisuus (massakonsentraatio) Näiden molekyylien molekyylipainoa ei yleensä tiedetä. Pitoisuus ilmoitetaan muodossa massa / tilavuus, esimerkiksi 815 µg/ml DNA:ta. Joskus tarvitaan näiden ainemäärä tai molekyylipaino. Silloin on tiedettävä DNA-, RNA- tai polypeptidiketjun pituus. Yhden nukleotidin molekyylipaino (M) on noin 330 g/mol, siispä n oligonukleotidi m oligonukleotidi 330 N, missä N oligonukleotidin pituus. V m c 33 ng 0,33 µl 100 ng/µl Reaktion pipetoidaan 0,33 µl oligonukleotidia. Esimerkki: PCR-reaktioon tarvitaan 5 pmol oligonukleotidia. Sinulla on tarvittavaa 20 emäksen pituista oligonukleotidia pitoisuudessa 100 ng/µl. Kuinka paljon oligonukleotidia pipetoit reaktioon? 17 Biokemian liuoslaskuja Yhden aminohapon molekyylipaino on keskimäärin noin 110 g/mol. Esimerkki: Proteiini sisältää 534 aminohappoa. Mikä on sen likimääräinen molekyylipaino? 534 110 g mol 58740 g 58,7 kda mol Proteiinien koon nimeämisessä käytetään rutiinisti yksikköä dalton (Da, D). 1000 Da 1 kda. Dalton on atomimassan yksikkö. 1 Da yhden vetyatomin paino ja vastaa numeerisesti 1 g/mol. 18 9

Biokemian liuoslaskuja Prosenttiosuudet liuoslaimennoksissa: weight w; volume v Liuenneen aineen massan osuus liuoksen massasta (w/w) Liuenneen aineen massa liuoksen tilavuudesta (w/v) Liuenneen aineen tilavuus liuoksen tilavuudesta (v/v) Esimerkkejä: Valmistetaan 5 % sakkaroosiliuosta (w/w) 100 ml: punnitaan 5 g sakkaroosia ja 95 g vettä (kun oletetaan että veden tiheys 1 g/ml, 95 mg 95 ml). Valmistetaan 70% etanoliliuosta (v/v) 100 ml: mitataan 70 ml puhdasta etanolia ja täytetään vedellä 100 ml:aan. Valmistetaan 20 % ammoniumpersulfaattiliuosta, APS (w/v), 10 ml: punnitaan 2 g ammoniumpersulfaattia ja liuotetaan se veteen siten, että lopullinen tilavuus on 10 ml. 19 Liuosten laimentaminen Kantaliuos Osuus käyttöliuoksen tilavuudes ta Osaa kantaliuosta 20x 1/20 1 19 10x 1/10 1 9 5x 1/5 1 4 2x 1/2 1 1 Osaa H 2 O Laboratoriossa tarvitaan usein suuria määriä liuoksia. Voidaan tehdä vahvuudeltaan esimerkiksi 5- tai 10- kertaisia kantaliuoksia, joita tarvittaessa laimennetaan 1-kertaiseksi käyttöliuokseksi. Kantaliuosten käyttö säästää aikaa ja vaivaa, varastointitilaa, vahvempi kantaliuos voi joskus myös säilyä paremmin. Ellei toisin ohjeessa mainita, käyttöliuos on aina 1-kertainen. Esimerkki: Valmistetaan 50 ml Tris-EDTA puskurin (TE-puskuri) 1x käyttöliuosta 10x TE-kantaliuoksesta (100 mm EDTA, 250 mm Tris/Cl, ph 8,0): 5 ml (1 osa) 10x kantaliuosta + 45 ml (9 osaa) H 2 O 50 ml 1x käyttöliuosta 20 10

Liuosten laimentaminen 0,3 M c 2 0,125 M V 2 100 ml V 1? V 1 c 2 V 2 V 1 c 2 V 2 0, 125 M 100 ml 0, 3 M 41, 7 ml Alkuperäisestä liuoksesta otetaan 41,7 ml ja laimennetaan se vedellä niin, että lopputilavuus on 100 ml. Kantaliuokset usein myös vain valmistettu tiettyyn konsentraatioon, josta ne laimennetaan eri käyttöliuoksiin tarpeen mukaan. Kun kantaliuoksesta (konsentraatio, kantaliuosta tilavuus V 1 ) tehdään laimennos (konsentraatio c 2, laimennoksen tilavuus V 2 ), ainemäärä n pysyy samana, vaikka tilavuus ja konsentraatio muuttuvat, eli V 1 c 2 V 2 Laskuesimerkki: Miten 0,3 M natriumkloridiliuoksesta valmistetaan 100 ml 0,125 M laimennosta? Monissa käytettävissä liuoksissa useampia komponentteja kunkin komponentin osuus lisätään toisistaan riippumatta yhteiseen lopputilavuuteen. 21 Kantaliuoslaskuja 3. 1. Kuinka valmistat 1 l seuraavia liuoksia? 1 M NaOH 10% NaCl (w/v) 10% metanoli (v/v) M(NaOH) 40 g/mol; M(NaCl) 58,4 g/mol; M(metanoli) 32 g/mol 2. Käyttämällä kohdassa 1 valmistettuja kantaliuoksia, kuinka valmistat 100 ml liuosta jossa on 500 mm NaOH, 1% NaCl, 1% metanolia? Kuinka valmistat ammoniumsulfaatista (MW 132 g/mol) 1 M liuoksen, jonka tilavuus on 500 ml? 4. Kuinka saat käyttäen kohdassa 3 valmistettua kantaliuosta tehtyä liuoksen, jonka tilavuus on 100 ml ja ammoniumsulfaattikonsentraatio 500 µm? 5. Proteiinin tuottamiseksi E. coli-kannassa BL21(DE3)pLysS, johon on siirretty proteiinia tuottava pet-15b plasmidivektori, soluja on kasvatettava kasvatusliemessä jossa on seuraavat antibioottikonsentraatiot: 50 µg/ml kanamysiini, 7 µg/ml gentamysiini ja 10 µg/ml tetrasykliini. Kuinka paljon pipetoit eri antibiootteja 500 ml:aan kasvatusliuosta, kun kunkin antibiootin kantaliuos on pitoisuudeltaan 10 mg/ml? 22 11

1. Kuinka valmistat litran: A. 1 M NaOH m cvm 1 mol 1 l 40 g 40 g mol Punnitaan 40 g NaOH ja liuotetaan dekassa vajaaseen 1 l H 2 O, siirretään mittapulloon ja täytetään merkkiin. B. 10% NaCl (w/v) Litra vettä painaa 1000 g, 10% tästä on % % 1000 g 100 g (tai 0,1 1000 g 100 g) Punnitaan 100 g NaCl ja liuotetaan dekassa vajaaseen 1 l H 2 O, siirretään mittapulloon ja täytetään merkkiin. NaCl:n molekyylipainoa ei tarvita. C. 10% metanoli (v/v) 1 l 1000 ml, 10% tästä on % 1000 ml 100 ml. % Mitataan 100 ml metanolia 1 litran mittapulloon ja täytetään vedellä merkkiin. Metanolin molekyylipainoa ei tarvita. 2. Kuinka valmistat näistä liuoksen jossa 500 mm NaOH, 1% NaCl, 1% metanoli (V 100 ml): V 1 NaOH c 2 V 2 V 1 NaCl V 1 metanoli V 1 c 2 V 2 c 2 V 2 c 2 V 2 0, 5 M 100 ml 50 ml 1 M 1% 100 ml 10 ml 10% 1% 100 ml 10 ml 10% Lisätään 100 ml mittapulloon 50 ml 1 M NaOH, 10 ml 1% NaCl, 10 ml 1% metanolia. Täytetään merkkiin saakka. Liuoslaskuissa voidaan käyttää konsentraationa erilaisia pitoisuutta ilmoittavia suureita: massakonsentraatiota (esim. mg/ml), pitoisuutta prosentteina tai pitoisuutta kertaisuutena (esim. 5x kantaliuos). 3. Kuinka valmistat ammoniumsulfaatista (MW 132 g/mol) 1 M liuoksen, jonka tilavuus on 500 ml? n m M, c n V m NH4 2 SO 4 cvm 1 mol 0, 5 l 132 g l mol 66 g Liuotetaan 66 grammaa ammoniumsulfaattia alle puoleen litraan vettä, siirretään 500 ml mittapulloon ja täytetään vedellä merkkiin saakka. 4. Kuinka saat käyttäen kohdassa 3 valmistettua kantaliuosta tehtyä liuoksen, jonka tilavuus on 100 ml ja ammoniumsulfaattikonsentraatio 500 µm? V 1 c 2 V 2 V 1 NH4 2 SO 4 c 2 V 2 500 µm 100 ml 1 M 5 10 4 M 100 ml 0, 05 ml 50 µl 1 M Pipetoidaan 50 µl ammoniumsulfaatin kantaliuosta 100 ml mittapulloon ja täytetään vedellä merkkiin saakka. 24 14.9.2018 Lisää tarvittaessa alatunnisteteksti 12

5. Kasvatusliemessä on seuraavat antibioottikonsentraatiot: 50 µg/ml kanamysiini, 7 µg/ml gentamysiini ja 10 µg/ml tetrasykliini. Kuinka paljon pipetoit eri antibiootteja 500 ml:aan kasvatusliuosta, kun kunkin antibiootin kantaliuos on pitoisuudeltaan 10 mg/ml? V 1 c 2 V 2 V 1 c 2 V 2 V kanamysiini µg 50 ml 500ml 2,5 ml 10000 µg/ml V gentamysiini 7 µg 500 ml ml 0,35 ml 350 µl 10000 µg/ml V tetrasykliini µg 10 500 ml ml 0,5 ml 500 µl 10000 µg/ml Antibioottien tilavuus on kokonaistilavuuteen verrattuna sen verran pieni, ettei niiden osuutta kokonaisuudesta tarvitse tarkasti ottaa huomioon. Mitataan steriilillä mittalasilla 500 ml kasvatusliuosta, ja pipetoidaan siihen 2,5 ml kanamysiiniä, 350 µl gentamysiiniä ja 500 µl tetrasykliiniä. Järkevämpi tapa toimia kuin yrittää aseptisesti mitata ~497 ml kasvatusliuosta mittalasi ei ole tarkka. 25 14.9.2018 Lisää tarvittaessa alatunnisteteksti Yleistä liuoslaskuista Jos laskenta V 1 c 2 V 2 kautta tuottaa päänvaivaa, voi tarvittavan määrän hakea myös toista kautta: 1. Mikä ainemäärä tai massa ainetta tarvitaan? Esim. Edellä kanamysiinin pitoisuuden tulee olla 50 µg/ml, kokonaistilavuuden 500 ml. m kanamysiini 50 µg 500 ml 25000 µg ml 25 mg 2. Kuinka paljon kantaliuosta tulee pipetoida, jotta tarvittava ainemäärä tai massa saadaan? V kanamysiini 25 mg 10 mg 2,5 ml ml Biokemian liuoslaskujen tyyppejä: Punnitus ja liuotus: Pitoisuus ilmoitettu molaarisuutena (esim. 50 mm 50 mmol/l): punnittava massa m c V M Pitoisuus ilmoitettu massakonsentraationa (esim. 10 mg/ml): punnittava massa m c V Laimentaminen: Pitoisuus ilmoitettu prosentteina %: 5% 10 ml V 1 c 2 V 2 2, 5 ml 20% Pitoisuus ilmoitettu molaarisuutena M (mol/l): V 1 c 2 V 2 100 mm 10 ml 2 ml 500 mm Pitoisuus ilmoitettu kertaisuutena (esim. 10x-kantaliuos): V 1 c 2 V 2 1x 5 ml 0, 5 ml 10x Jos samassa liuoksessa on monta komponenttia, niiden osuus lasketaan muista riippumatta samaan lopputilavuuteen! 26 14.9.2018 Lisää tarvittaessa alatunnisteteksti 13

Sterilointi ja desinfiointi Desinfiointi vähentää mikrobien määrää, mutta sillä ei voida varmistaa kaikkien mikro-organismien tuhoutumista. Tärkeä osa labran arkea ja siivoamista vähentää mikrobien määrää ja siten kontaminaatioriskejä. Steriloinnilla varmistetaan, ettei käytetyissä välineissä tai reagensseissa ole eläviä mikro-organismeja (viruksia, bakteereita, bakteerien itiöitä, jne.) Molekyylibiologian, solubiologian ja mikrobiologian töissä kaikkien käytettävien liuosten, reagenssien ja välineiden tulee olla steriilejä. Bakteeri- tai soluviljelmässä ei saa olla ylimääräisiä mikrobeja. Näytteissä ei saa olla vierasta DNA:ta tai RNA:ta. Näytteissä ei saa olla RNAaseja (DEPC-käsitelty vesi). 27 Sterilointitapoja Autoklavointi: Sterilointi paineistetussa vesihöyryssä. Lämpötila vähintään 121 C, yhden ilmakehän eli 101 kpa:n (1 bari) ylipaine. Normaali tapa steriloimattomien liuosten sekä steriloimattomien muovisten astioiden ja muovisten kertakäyttövälineiden sterilointiin. Steriloitavat liuokset autoklaavin kestäviin pulloihin (pyrex), täyttö max. 80% tilavuudesta. Korkki löysästi kiinni, korkin ympärille folio, ja folioon autoklaavimerkkiteippi. Pieni muovitavara (pipetinkärjet, putket) pakataan autoklaavipusseihin, tai autoklaavin kestävään astiaan, jonka suu peitetään foliolla. Myös steriloitavien mittalasien suu peitetään. 28 14

Muita sterilointitapoja Kuumailmasterilointi Lämpökaappi, jossa kuuma ilma kiertää (170 C, 1 t). Lasisten ja metallisten astioiden sterilointiin. Ionisoiva säteily (gammasäteilytys). Välineiden valmistaja huolehtii. Tyypillisesti materiaalia, joka ei kestä autoklavointia (esimerkiksi polystyreeniset muovilaadut). Suodattaminen Vähintään 0,22 µm steriili filtteri. Liuokset, joita ei voida autoklavoida (sokeriliuokset, SDS, antibiootit). 29 15