BIOAEROSOLIEN TOKSIININ TUOTTO JA HIUKKASKOKO TYÖTILOJEN SISÄILMAN PUHTAUDEN MITTARINA

Transkriptio

1 Sisäilmastoseminaari BIOAEROSOLIEN TOKSIININ TUOTTO JA HIUKKASKOKO TYÖTILOJEN SISÄILMAN PUHTAUDEN MITTARINA Mirja Salkinoja-Salonen 1, Maria A. Andersson 1, Stiina Rasimus 1, Pekka Salin 1, Raimo Mikkola 1, Harri Alenius 2, Sampsa Matikainen 2, Marina Leino 2 ja Risto Salin 3 (ToxicDust konsortio) 1 Elintarvike- ja Ympäristötieteiden laitos, Helsingin Yliopisto 2 Immuunitoksikologian kärkiyksikkö, Työterveyslaitos, Helsinki 3 Inspector Sec Oy, Haukipudas TIIVISTELMÄ Työtilojen bioaerosoleja kerättiin ravinnemaljoille 6-vaihe-impaktorilla 0,5 m 3 :sta ilmaa ja yhden tunnin laskeumina. Impaktori lajittelee aerosolihiukkaset kuuteen kokoluokkaan välillä <1 µm - >7µm. Maljat suljettiin ja kasvatettiin 3 5 viikkoa, mikrobikasvusto kerättiin ja sen toksisuus sian siittiöille ja munuaissoluille mitattiin. Valituskohdenäytteiden (n= 113) EC50 arvoista siittiöille 61 % oli alle < 5 µg/ml, ja verrokkikohdenäytteistä (n= 43) vain 2 % oli < 5 µg/ml ja 62% > 50 µg/ml. Munuaissoluilla vastaava luku 61 %:ssä valituskohdenäytteitä oli EC50 < 60 µg/ml, verrokeilla 70 % EC50 arvoista oli 250 µg/ml. Ihmisen makrofageille tehdyissä laboratorio-altistuksissa havaittiin valituskohdenäytteen aiheuttavan sytokiinin IL-1β erityksen, kun verrokkikohdenäyte ei vaikuttanut tämän sytokiinin tuottoon mitenkään. Tulokset osoittavat, että sisäilman terveyshaittaan liittyy bioaerosolin toksisuus. TAUSTAA Kosteusvauriorakennuksia kolonisoiva mikrobisto on monimuotoinen, eikä ole löydetty yhtä tai edes rajallista joukkoa mikrobilajeja, joiden esiintyminen korreloisi terveyshaittojen esiintymiseen /1/. Rakennuksista ei ole löydetty mikrobia, joka aiheuttaisi ihmisessä infektion. Useissa tutkimuksissa on ehdotettu, että terveyshaitan aiheuttaja olisi jokin mikrobiperäinen aine, metaboliitti kuten esim. mykotoksiini eli sienimyrkky. Mykotoksiineista on julkaisuja, mutta niitä on löydetty vain toksisuusrajojen alapuolelle jääviä määriä, eikä pitoisuuksissa löydetty eroa hometalon ja terveen talon välillä /2-5/. Suurin osa sisätiloihin sairastuneista jää vaille ammattitautidiagnoosia, koska työterveysviranomaisen lausunto toteaa, että näyttöä haittatekijälle altistumisesta työtiloissa ei ole /6/. Menetelmille, joilla näyttö saadaan osoitetuksi, on siten suuri tarve. Työsuojelurahasto myönsi v. 08 tutkimuskonsortiolle TOXICDUST tutkimusmäärärahan (08-10) Mikrobitoksiineille työtiloissa altistumisen laadullisen ja määrällisen mittausmenetelmän kehittämiseen (TSR hanke ). Hanke onnistui ja seuraavassa esitellään sen tärkeimmät tulokset. TUTKIMUKSEN TOTEUTTAMINEN Työhypoteesi Tutkimus toteutettiin vastehakuisella menetelmällä. Vastehakuinen tutkimus on menetelmä, jota käytetään ympäristötoksikologiassa silloin kun haitan aiheuttava aine ei

2 104 Sisäilmayhdistys raportti 29 ennakkoon ole tiedossa, tai samoja haittoja aiheuttavia aineita on monia ja niiden kesken yhteisvaikutuksia. Yksittäisten aineiden analysoiminen erikseen kemian menetelmin ei silloin ole järkevää eikä taloudellisesti mahdollistakaan. Näin tehdään esimerkiksi kalojen lisääntymisterveyttä häiriköivien päästöjen (endocrine disrupters, ECD) tunnistamiseen meristä. ECD-vaste mitataan solutoksikologisesti hormoniriippuvia soluja koesoluna käyttäen /7/. Vastehakuisuus, engl. effect based, tarkoittaa siis sitä, että etsitään vaste (haitta), ja vasteen vakavuudelle mittareita. Edetään siis niin kuin poliisi, rikospaikan (lue: sisätila) tutkimuksesta, todisteiden (lue: näytteet) tutkinnasta rikoksen tekijöiden (lue: mikrobi tai aine) osoittamiseen. Tässä tutkimuksessa haettiin toksista vastetta sisätiloista. Tutkimusnäytteet olivat sisäilman aerosolin eri jakeita, koska ilman sisältämät komponentit ovat käyttökelpoinen tutkimuskohde, kun verrataan sisäilmahaitoista kärsivän kohteen ( valituskohteet ) altisteita tiloihin, joissa haittoja ei ollut tiedossa ( verrokkikohteet ). Tutkimusmenetelmät Näytteiden keruu. Sisäilman hiukkasia kerättiin hiukkaskoon mukaan lajittelevalla Graseby-Andersen 6-vaihe impaktorilla ( min), IKIkeräimellä (1-vaiheimpaktori, koostettu tätä hanketta varten näytteiden ottoon ahtaista kohteista kuten ilmastointikanavasta ja seinien välisistä tiloista), pölyä keräämällä lattian yläpuolisilta pinnoilta (arkistohyllyn päältä, valaisinten päältä), pyyhintä- ja kontaktinäyttein sekä laskeuma maljoilla (maljat auki tunnin ajan). Sisätilan aerosoleja kerättiin sähköstaattisilla keräimillä (Fa6, InspectorSec, Haukipudas, 400m 3 /h, h) /8,9/. Tutkimuskohteet valittiin niiden kiinteistöjen joukosta, joista tutkimuskonsortiolle toimitettiin tutkimuspyyntö. Osa tiloista oli valituskohteita, osa verrokkikohteita. Verrokkikohde etsittiin valituskohteen esittäjän avustuksella (koulu vs. koulu, toimisto vs. toimisto, päiväkoti vs. päiväkoti). Kirjaaminen valitus tai verrokki kohteeksi tehtiin sellaisena kuin se saatiin k.o. tilojen haltijalta tai työsuojeluhenkilöstöltä. Osasta kohteita näytteenotto toistettiin 2 4 kertaa, eri vuodenaikoina. Näytteiden käsittely. Impaktorinäytteet ja laskeumat kerättiin antibiootittomille viljelymaljoille mallas agar, 8 g mallasuutetta ja 12 g agaria/400ml) ja tryptoosi- soija agar (kaupallinen tuote, Scharlau-Chemie), joille myös pölynäytteet viljeltiin. Maljat teipattiin keräyspaikalla umpeen kaasuja läpäisevällä teipillä ristikontaminaatioiden ja kuivumisen ehkäisemiseksi. Kasvustojen muodostuttua (3 5 viikkoa, 22± 1 ºC, vetokaapissa) biomassat niistä kerättiin ja valmistettiin etanoliuutteiksi kuten on kuvattu toisaalla /9/. Toksisuuden mittaus. Siittiötoksisuus mitattiin solujen aktiivisen liikkeen lakkaamisena kuten kuvattu muualla /8,9/ ja tässä vain lyhyesti. Sian (maatiais- ja Yorkshire) siittiöt (FabaSika Oy, Tuomikylä), 27 milj. solua/ml, altistettiin näyteuutteille ja niiden 2- portaisille laimennoksille (1:1 1:64 etanoliin 96 til %, EtaxA, Altia) ja vastaaville etanolikontrolleille (0,1 1 % etanolia),18 ºC. Liikkuvuus luettiin mikroskoopilla (käänteisfaasi 40 obj.) 37 ºC:seen lämmitetyistä näytteistä. Mittaukset tehtiin usean donorikarjun siittiöillä. Tulokset eri karjuilla poikkesivat korkeintaan yhden laimennusaskeleen verran. Munuaissolutoksisuus mitattiin sian proksimaalisten tubulusten epiteelisoluilla (PK-15, 0,2 milj. solua/ml), joita kasvatettiin RPMI 1640 liemessä (Gibco, glutamiinilisäyksellä), steriilissä kaapissa (HERAcell 150i) 37±0,2 ºC, 5 % hiilidioksidia sisältävässä ilmakehässä, RH %. Soluista mitattiin sytolyysi mikroskooppisesti. Toksisuus ihmisen makrofageille (terveistä donoreista, monosyyteistä laboratoriossa erilaistettu) mitattiin siten kuin kuvattu /10/. Immunoreaktiivisuuden mittarina käytettiin tulehdussytokiini IL-1β erittymistä LPS aktivoiduista makrofageista. Kalibrointi- ja praimausaineina toksisuusmittauksissa käytettiin triklosaania (myrkyllinen desinfiointiaine,

3 Sisäilmastoseminaari ,4,4 -trikloori-2 -hydroksidifenyylieetteri, Merck), sitriniini (Penicillium expansum ja Aspergillus terreus sienten mykotoksiini), roridiini (Stachybotrys chartarum sienen trikotekeeni toksiini) ja LPS (Escherichia coli, 0111:B4) (Sigma Aldrich). TUTKIMUKSEN TULOKSET Valituskohteissa sisäilman hiukkasten kasvustot olivat toksisempia kuin verrokkikohteissa Taulussa 1 on yhteenveto 156:sta sisäilmakasvustosta mitatusta siittiötoksisuudesta. EC50 (engl. effective concentration) tarkoittaa sitä näyteuutteen pitoisuutta, mikrogrammoina millilitrassa (µg/ml), joka lamautti siittiöiden uintikyvyn yli 50 %:ssa altistetuista. Vertailunäytteenä oli aina samasta siittiöerästä tehty altistus, jossa näytteen asemesta oli altisteena näytteen valmistukseen käytetyt reagenssit. Taulu 1. Aerosolihiukkaskasvustojen ominaistoksisuus sian siittiöillä mitattuna. Aerosolihiukkaskasvustot kerättiin, uutettiin etanoliin ja ominaistoksisuus mitattiin. Altistusaika: 30 min, EC 50 µg/ml n= < Valituskohteiden näytteet, kpl % 13 % 22 % Verrokkikohteiden näytteet, kpl <3 % 22 % 78 % kaikki näytteet Altistusaika: 3 4 d EC 50 µg/ml n= Valituskohteiden näytteet, kpl %* 5 % 12 %* Verrokkikohteiden näytteet, kpl %* 23 % 62 %* kaikki näytteet, kpl Tuloksista nähdään, että jo ½ tunnin altistus siittiöille erotteli valituskohteiden näytteet (65 % <30 µg/ml) verrokkikohteista (< 3 %, eli 0 näytettä toksisimmassa luokassa). Kun altistusaikaa pidennettiin 1 ja 3-4 päivän mittaiseksi, sama ero näkyi voimistuneena. Paras tilastollinen merkittävyys* saatiin 3-4 päivän altistuksessa, koska tällä altistusajalla tehtiin eniten mittauksia (n= 129). Taulusta 1 nähdään, että valituskohdenäytteistä mitatuista EC 50 arvoista 61 % oli alle 5 µg/ml (= suuri toksisuus), kun verrokkikohdenäytteistä saaduista EC 50 arvoista vain 5 % oli alle 5 µg/ml. Verrokkikohdenäytteiden EC 50 arvoista 62 % ylitti arvon 50 µg/ml. (=toksisuus oli pieni). Valituskohdenäytteissä näitä ei-toksisia oli 12 %, ja kaikki työtiloista, joista oli saatu myös toksinen näyte. Taulu 2 on kooste munuaissolutoksisuuksista (PK-15). Taulu 2 osoittaa, että valituskohdenäytteistä (n = 47) 61 % antoi EC 50 arvon 60 µg/ml ja verrokkiaineistossa (n= 27) vain 4 mittausta (15 %) alitti tämän ja pääosa (70 %) oli ei-toksisia, EC µg/ml. Tulos on siis hyvin samansuuntainen kuin siittiösoluilla saatu tulos (Taulu 1). Hiukkaskokojakaumien tarkastelu (Graseby-Andersen impaktorikeräinnäytteet) osoitti, että toksisuuden tuottoa löytyi valituskohteista mallas agarilla eniten hiukkaskoko luokissa 7 µm, 2,1-3,3 µm, 1,1-2,1µm ja 0,65 1,1 µm (pääosin sieniä) ja tryptoni-soija agarilla kokoluokissa 1,1-2,1µm ja 0,65 1,1 µm (pääosin bakteereja). Kun maljoilta poimittiin pesäkkeitä ja tutkittiin niiden toksisuus (n= 117), havaittiin että monessa valituskohteessa 70 % tutkituista erinäköisistä pesäkkeistä oli toksisia, kun verrokkikohteissa

4 106 Sisäilmayhdistys raportti 29 toksisten osuus aina oli alle 10 % ja useimmiten 0 %. Tulokset osoittivat, että toksiinin tuottajat olivat valtalajeina valituskohteissa ja toksiinin tuottajia oli monia, ulkonäöltään erilaisia (jopa kymmeniä). Taulu 2. Aerosolihiukkaskasvustojen ominaistoksisuus sytolyysin aiheuttajana sian munuaissoluilla (PK-15). Näytteet kerättiin ja käsiteltiin kuten Taulussa 1. Altistus 2 d Sytolyyttinen toksisuus EC 50 µg/ml n= Valituskohdenäytteet, kpl % Verrokkikohdenäytteet, kpl % tutkitut näytteet kaikkiaan 74 Immunoreaktiivisuuden määrittäminen kohteista kerätyistä näytteistä Immunoreaktiivisuutta tutkittiin ihmisen makrofageilla, jotka oli laboratoriossa erilaistettu terveiden verenluovuttajien monosyyteistä (Kuva 1). Näytteet oli kerätty sähköstaattisella suotimella ja laskeumana. Toksisesta sisätilapölystä oli myös eristetty toksiinintuottajabakteeri ja sen toksiini. Immuunireaktiivisuuden mittarina käytettiin tulehdussytokiini IL-1β:n erittymistä. Erittyminen mitattiin soluviljelynesteestä ELISA-menetelmällä. Immunoreaktiivisuutta (IL-1beta tuotanto) havaittiin valituskohteesta eristetystä toksiinia tuottavasta bakteerista (Bacillus amyloliquefaciens 19b), sekä bakteerista eristetystä toksiinista (amylosiini) /11/. A) IL-1beta eritys B) IL-1beta eritys pg/ml 00 pg/ml kontrolli LPS 19b IAM b IAM kontrolli LPS Amylosiini Amylosiini Roridiini + LPS + LPS C) IL-1beta eritys pg/ml oireellinen kohde oireeton kohde reagenssi/muu kontrolli kontrolli LPS Roridin aerosoli (sähkösuodin) viljely (laskeuma malja) laskeuma pyyhintä pöly pöly (pölynimuri) Kuva 1.

5 Sisäilmastoseminaari Kuvan 1 tulos osoittaa, että sekä tämän bakteerin biomassasta tehty etanoliuute (Kuva 1A), että siitä puhdistettu toksiini (Kuva 1B), käynnistivät sytokiini IL-1β:n erityksen LPSaktivoiduissa makrofageissa. Sytokiinin tuottoa ei tapahtunut kun samat altistukset tehtiin saman bakteerin toisella kannalla (B. amyloliquefaciens IAM 1521) joka ei tuottanut amylosiinia. Tuloksista voi päätellä, että sytokiinireaktio oli todennäköisesti toksiinin aiheuttama. Kuva 1C vertaa valituskohdenäytteiden ja verrokkikohdenäytteiden immunoreaktiivisuuksia. Näytteet kerättiin kolmella eri tavalla: i) sähköstaattisella suotimella (#1,2) /9/, ii) laskeumamaljakasvustoina (#3,4) ja iii) pölynimurilla (#5,6) /9/. Siittiö- ja munuaissolutestissä toksisin näyte oli #3 (EC50, siittiö, 1,5 µg/ml ja munuaissolu, 15 µg/ml). Kuvan 1C tulokset osoittavat, että ainoastaan näyte #3 käynnisti sytokiini IL-1β:n erityksen LPS-aktivoiduissa makrofageissa. Tulokset osoittivat, että terveyshaittavalituskohteista voi löytyä toksiineja, joiden immunoreaktiivisuus on in vitro mitattavissa ihmisen makrofageilla. TULOSTEN MERKITYKSESTÄ Tämän hankkeen alkupään tuloksista (v. 08-9) raportoitiin v. 10 Sisäilmastoseminaarissa. Silloin esiteltiin sähköstaattisilla suotimilla kerättyjen aerosolien ja pölyjen toksisuutta /8,9/. Valituskohteiden (n= 17) aerosolien toksisuuden EC 50 ikkuna oli 0,8 12 µg/ml, ja verrokkikohteissa - 50 µg/ml. Kyseessä oli ensimmäinen tieteellinen tutkimus, jossa löydettiin selkeitä toksisuuseroja valituskohteista kerätyissä näytteissä verrokkikohteisiin verrattuna. Tässä esityksessä raportoidaan uudella tavalla valmistettujen v sisätilanäytteiden toksisuustuloksista. Impaktio- ja laskeumanäytteistä prosessoitiin kasvustoja, joiden toksisuus mitattiin kahdella eri solutyypillä, siittiöillä ja munuaissoluilla. Näytemäärä (n= 156) oli suuri, niitä oli 36 kiinteistöstä, yhteensä 70 eri tilasta ja ne kerättiin lyhyenä aikana (1 h) tilojen haltijoiden työaikana. Valitus- ja verrokkikohteiden näytteiden toksisuuksissa (EC 50 ) löytyi suuria eroja: pääosa (68 76 %, altistusajasta riippuen) valituskohdenäytteitä antoi EC 50 (siittiö) arvoja 5 µg/ml, kun verrokkikohteista pääosan EC 50 oli 50 µg/ml. Testisolut sietivät siis verrokkikohteiden mikrobituotteita yli kymmenkertaisen pitoisuuden valituskohteiden näytteisiin verrattuna. Lisäksi tällä näytteenkäsittelymenetelmällä onnistui saada näkyviin myös immuunitoksisuus, jota ei sisäilman aerosoleista koskaan aiemmin ole raportoitu. Tulosten perusteella näyttäisi olevan mahdollista ennustaa sisätilojen toksista altistusta seuraavasti: Sisäilman mikrobeihin liittyviä terveyshaittoja on odotettavissa tiloissa, joiden kahdessa tai useammassa näytteessä mikrobikasvustojen EC 50 siittiöille on 5 µg/ml ja munuaissoluille 60 µg/ml. Sisäilman mikrobeihin liittyviä terveyshaittoja ei ole odotettavissa tiloissa, joista saatujen vastaavien näytteiden EC 50 siittiöille oli 50 µg/ml ja munuaissoluille 250 µg/ml. Näiden ääripäiden väliin jäävä alue edellyttää lisänäytteiden tutkimusta. Toksiinia tuottavia näytteitä ei välttämättä saada työhuoneen mistä tahansa kohdasta ja ilmanäytteiden laatu voi ajallisesti vaihdella. Tämä tutkimus tarjoaa työvälineen tilanteeseen, jossa mikrobeja epäillään kosteusvauriorakennuksissa esiintyvien terveyshaittojen aiheuttajiksi, mutta virallisesti hyväksytyt keinot sen todentamiseksi puuttuvat. Valviran viranomaisohjeen /12/ mukaan on pitäydyttävä v. 09 Asumisterveysohjeen soveltamisoppaassa /13/ esitettyihin menetelmiin, ja nimetään nämä ainoiksi Terveydensuojelulain /763/ tarkoittamiksi menetelmiksi. Näin siis on, vaikka näillä nimenomaisilla menetelmillä saadut tulokset (mikrobiviljelyiden pesäkelukumäärät) tiedetään korreloimattomiksi

6 108 Sisäilmayhdistys raportti 29 terveyshaittoihin eikä niiden perusteella ole onnistunut ennustaa työtilojen turvallisuutta korjausrakentamisen jälkeen /1/. KIITOKSET Tutkimuskonsortio kiittää tuesta Työsuojelurahastoa (TSR hanke ) ja Suomen Akatemiaa (CoE Photobiomics, ). Kiitämme hankkeen seurantaryhmää (prof. Aino Nevalainen, prof. Kimmo Peltonen, prof. Ralf Lindberg, prof. Kari Reijula, tutkimusasiamies Ilkka Tahvanainen) kiinnostavista keskusteluista ja tuesta. Kiitämme asiantuntijaavusta prof. Tuula Putusta, tri Tuomas Holmaa, prof. Ville Valtosta ja kiitämme yhteistyöstä tutkimuksessa mukana olleiden kiinteistöjen henkilöstöä ja työsuojeluvastaavia sekä kiinteistöjen haltijoita ja omistajia tutkimusluvista. LÄHDELUETTELO 1. Kosteusvauriot työpaikoilla. (09).Kosteusvauriotyöryhmän muistio. Sosiaali- ja terveysministeriön selvityksiä. 09: s. 2. Tuomi, T., Reijula, K., Johnsson, T., Hemminki, K., Hintikka, E.-L., Lindroos, O., Kalso, S., Koukila-Kähkölä, P., Mussalo-Rauhamaa, H., Haahtela, T. (00). Mycotoxins in crude building materials from water damaged buildings. Appl Envir Microbiol 66, Bloom, E., Nyman, E., Must, A., Pehrson C., Larsson L. 09. Molds and Mycotoxins in indoor environmens a survey in water damaged buildings. J Occup Envir Hyg6, Brasel, T.L., Martin, J.M., Carriker, C.G., Wilson, S.C., Straus, D.C. (05). Detection of airborne Stachyborys macrocyclic trichothecene mycotoxins in the indoor environment. Appl Envir Microbiol, 71, Gottschalk, C., Bauer J., Meyer, K. (08). Detection of satratoxin G and H in indoor air from a water-damagend building. Mycopathologia, 166, Nordman, H., Uitti, J., Toskala-Hannikainen, E., Kari, O., Piipari, R. (07). Kosteusvauriomikrobien aiheuttamien sairauksien tutkiminen. Suomen Lääkärilehti 62(9), Kuch, B., Kern, F., Metzger, J.W., von der Trenck K.T. (10). Effect-related monitoring: estrogen-like substances in groundwater. Environ Sci Pollut Res, 17, Salkinoja-Salonen, M., Mikkola, R., Andersson, M.A., Alenius, H., Matikainen, S., Salin, P., Rasimus, S., Mattila, S. (10). Solumyrkyllisiä aineita työpaikkailmassa. Sisäilmastoseminaari 10, SIY Raportti 28, Andersson, M.A. Mikkola, R., Rasimus, S., Hoornstra, D., Salin, P., Rahkila, R., Heikkinen, M., Mattila, S., Peltola, J., Kalso, S, Salkinoja-Salonen, M. (10). Boar spermatozoa as a biosensor for detecting toxic substances in indoor dust and aerosols. Toxicology in Vitro, 24, Kankkunen, P., Rintahaka, J., Aalto, A., Leino, M., Majuri, M-L, Alenius, H., Wolff, H., Matikainen, S. (09). Trichothecene mycotoxins activate inflammatory reponse in human macrophages. J. Immunology 182, Mikkola, R.; Andersson, M.A., Teplova, V., Grigoriev P., Kuehn T., Loss S., Tsitko,I., Apetroaie A., Saris, N-E. L., Veijalainen, P., Salkinoja Salonen, M.S. (07). Amylosin from Bacillus amyloliquefaciens, a K + and Na + channel forming toxic peptide containing a polyene structure. Toxicon, 49, Valvira. (10). Toksiinimenetelmien käyttö terveydensuojelulain mukaisissa viranomaistutkimuksissa. Ohje viranomaisille 5/10. Dnro 4805/11/ / Asumisterveysopas 3. korjattu painos. Sosiaali- ja terveysministeriön Asumisterveysohjeen soveltamisopas (09), s ja