Tiivistelmä tutkimuksesta

Transkriptio

1 1 Tiivistelmä tutkimuksesta SYLJEN METABOLIITTIPROFIILI SUUN PUNAJÄKÄLÄÄ SAIRASTAVILLA POTILAILLA Salivary metabolomics in patients with Oral Lichen Planus Igor Laitinen, HLK Hammaslääketiede Oulun yliopisto Tammikuu 2016 Ohjaaja: Arja Kullaa

2 2 Hammaslääketieteen lisensiaatin tutkintoon kuuluvat syventävät opinnot suoritin osallistumalla tutkimusprojektiin, jossa tutkittiin syljen metaboliittiprofiilia Lichen planusta sairastavilla potilailla verrattuna terveisiin henkilöihin. Osallistuin tutkimukseen tekemällä kirjallisuusselvityksen, tutkimalla potilaita, keräämällä sylkinäytteitä sekä osallistumalla tulosten analyysiin ja artikkelin kirjoittamiseen. Syventävän opinnäytetyön pohjalta tullaan laatimaan tieteellinen artikkeli julkaistavaksi alan tieteellisessä julkaisusarjassa. Johdanto Solun aineenvaihdunta eli metabolia on biokemiallisten reaktioiden sarja, jolloin solut tuottavat erilaisia molekyylejä aineenvaihdunnan tuotteina. Metabolomiikka on taasen pienikokoisten molekyylien eli metaboliittien pitoisuusmittauksia elimistön soluissa, kudoksissa ja kudosnesteissä, ja kemiallisten aineenvaihduntatuotteiden toiminnan ja vaikutusten tunteminen. Metabolomiikka on varsin uusi mentelmä etenkin sylkitutkimuksissa (Mikkonen et al. 2015). Metabolomiikan avulla voidaan löytää suusairauksien biomarkkereita, joita voidaan tulevaisuudessa käyttää sairauksien varhaisdiagnostiikassa, sekä ennusteen, sairauden kulun ja hoitovasteen seurannassa. Metaboliitteja voidaan tutkia eri mentelmin, kuten massaspektrometrialla ja NMR-spektroskooppilla (nuclear magnetic resonance). Analyysillä pyritään kartoittamaan kokonaisvaltaisesti aineenvaihduntatuotteiden profiili tietyllä hetkellä. Lichen ruber planus eli punajäkälätauti on krooninen tulehduksellinen autoimmuunisairaus. Se voi esiintyä sekä iholla että suun limakalvoilla. Iholla se ilmenee tyypillisesti kutiavina näppylöinä. Suun punajäkälä (oral lichen planus=olp) on kuitenkin ihon punajäkälää tavallisempi taudin ilmenemismuoto. OLP luokitellaan kuuteen eri muotoon. Valkoiset eli leukoplaakkiset lichen leesiot ovat verkkomaisia, papulaarisia tai plakkimaisia. Punaiset lichen leesiot ovat atrofis-erosiivisia, ulseratiivisia tai rakkulaisia. Punoittavaan ja haavaumamuotoon voi liittyä limakalvojen

3 3 arkuutta, polttelua, kirvelyä, verenvuotoa, turvotusta ja arpeutumista. Kaikki suun hyperkeratinisoituneet valkoiset muodot ovat yleensä oireettomia. Samanaikainen suun hiivatulehdus voi pahentaa oireita. Sairauden aiheuttamaa haittaa voidaan vähentää, mutta parantavaa hoitoa ei ole. On osoitettu, että suun punajäkälä voi muuttua pahanlaatuiseksi kasvaimeksi (McCartan & Healy 2008). Lichen muutoksia esiintyy varsinkin poskissa, kielessä ikenissä ja niille on tyypillistä symmetrinen esiintyminen suun limakalvoilla. Erotusdiagnostisesti tavallisin ja tärkein tila on lichen planuksen kaltainen muutos eli lichenoidi-reaktio. Lichenoidi-reaktio eroaa punajäkälästä niin, että se on usein paikallinen ja yksittäinen. Sylki huuhtelee suuta, tekee ruoan liukkaaksi ja hillitsee bakteerien kasvua. Ihmisen sylki on pääasiassa vettä, mutta se sisältää elektrolyyttejä sekä bakteereja ja niiden entsyymejä, viruksia ja sieniä. Lisäksi syljessä on verta, seerumin eksudaattia ja tulehdussoluja. Syljessä on myös metaboliatuotteita, joita voidaan käyttää biomarkkereina suun limakalvosairauksien diagnosoinnissa. Diagnostiikan kannalta biomarkkerit ovat tärkeässä roolissa, koska niiden avulla voidaan tunnistaa tauti sen varhaisessa vaiheessa sekä seurata hoidon tehoa. Lisäksi syljen kerääminen on helppoa, se on potilasystävällinen ja noninvasiivinen menetelmä verrattuna muihin tutkimusmenetlmiin. Syljen metaboliaprofiiliin vaikuttavat monet tekijät (Kuva 1), jotka voivat olla sisäisiä tai ulkoisia tekijöitä. Oletetaan kuitenkin, että monet sairaudet vaikuttavat syljen metaboliaan. Jokaisella henkilöllä on tiettynä aikana tietty metaboliaprofiilli, ja kun näytteenotto vakioidaan ja ulkoiset tekijät poissuljetaan, voidaan yksilöllisesti seurata tietyn henkilön metaboliaprofiilissa tapahtuvia muutoksia, esimerkiksi lääkityksen vaikutusta sairauden kulkuun.

4 4 Extrinsic substances (food, habits, smoking etc.) Salivary glands Oral microbes Systemic diseases Oral mucosa and oral mucosal diseases Blood derivatives, bronchial and nasal secretions Oral health (caries, parodontitis etc.) Medication COMPOSITION OF WHOLE SALIVA Kuva 1. Syljen metaboliaprofiilin vaikuttavat tekijät Tässä tutkimuksessa selvitettiin syljessä olevia OLP:n biomarkkereita ja eri tutkimusmenetelmiä kirjallisuuteen perustuen. Lisäksi tutkimuksessa selvitettiin suun punajäkäläää sairastavien potilaiden syljen metaboliprofiilissa olevat muutokset verrattuna terveiden henkilöiden ja suupoltteesta kärsivien henkilöiden metaboliaprofiiliin. Hypoteesi: Limakalvon muutokset aiheuttavat syljen metaboliaprofiilissa muutoksia, jotka voisivat olla varhaisdiagnoosin kannalta merkittäviä ja soveltuisivat hoidon seurantaan.

5 5 Tutkimuksen aineisto ja mentelmät Tutkimusaineiston muodostaa 15 tervettä aikuista, joista 9 oli naisia ja 6 miestä sekä ikäjakauma vuotta. Kultakin tutkittavalta kerättiin sekä stimuloitua että leposylkeä standardisoidun menetelmän mukaan (Navazesh 1993). Lisäksi 9 potilasta (7 naista ja 2 miestä; ikäjakauma vuotta), joilla todettiin suun punajäkälä (Kuva 2), osallistuivat tutkimukseen. Tutkittavilta kerättiin sylkinäytteet aamulla klo 9-11 välillä vuorokausivaihtelun minimoimiseksi. Tutkimushenkilöitä kehoitettiin olemaan syömättä ja juomatta vähintään tunti ennen sylkinäytteen keräystä. Välittömästi näytteiden keräyksen jälkeen mitattiin syljen ph. Lisäksi laskettiin syljenritysnopeus (ml/min). Näytteet sentrifugoitiin ja supernantti säilytettiin asteessa ennen tutkimusta. Kuva 2. Posken limakalvoilla tyypilliset vaaleat lichen-muutokset. Tässä tutkimuksessa sylkinäytteet tutkittiin NMR-spektroskopialla. NMR on lyhenne sanoista Nuclear Magnetic Resonanse eli ydinmagneettinen resonanssi. NRM-spektroskopia perustuu siihen, että magneettisten atomiydinten energiatilat ja ydinten käyttäytyminen magneettikentässä riippuvat ydinten fysikaalis-kemiallisesta ympäristöstä ja nämä riippuvuudet näkyvät ydinmagneettisen resonanssisignaalin spektrissä mm. resonanssitaajuuden kemiallisena siirtymänä.

6 6 Tuloksia vertailtiin Lichen-potilaiden ja kontrollihenkilöiden välillä Kruskal-Wallisin testillä. Tulos katsottiin merkitseväksi, kun p<0.05. Tulokset Kirjallisuusselvitykseen perustuen taulukossa 1 esitetään eri menetelmiä, joita on käytetty syljen biomarkkereiden tutkimisessa. (liite 1) Syljen ph.ssa sekä eritysnopeudessa ei ollut merkittäviä eroja potilaiden ja kontrollien välillä. NMR-analyysillä saatiin esiin 24 eri metaboliittia. Tilastollinen analyysi osoitti asetaatin, etanolin, metyyliamiinin ja pyruvaattihapon olevan koholla OLP potilailla, kun taas tyrosiinipitoisuudet olivat alentuneet (Taulukko 3). Muiden metaboliittien suhteen ei ollut tilastollista eroa Lichen potilaiden ja kontrollihenkilöiden välillä. Kuvassa 3 esitetään OLPpotilaiden suhteellinen metaboliittiprofiili verrattuna kontrolleihin eroavien metaboliittien suhteen. Controls OLP Kuva 3. Asetaatti, etanoli, metyyliamiini ja pyruvaattihappo olivat koholla Lichen potilailla verrattuna kontrolleihin, kun taas tyrosiini oli alentunut Lichen potilailla. Metaboliittien suhteelliset konsentraatiot OLP/kontrollit. Pohdintaa

7 7 Tutkimuksissa osoitettiin, että syljen biomarkkereissa on eroja terveen yksilön ja sairastuneen yksilön välillä. Viiden metaboliitin olevan koholla ja tyrosiinin olevan alentunut suun licheniä sairastavilla potilailla kontrollihenkilöiden sylkipitoisuuksiin nähden. Tulos on mielenkiintoinen, koska aiemmin on osoitettu mahdollinen yhteys OLP:n ja hypotyreoosin välillä (Siponen et al. 2010). Kuitenkin tarvitaan lisätutkimuksia ennen kuin voidaan arvioida syljen tyrosiinipitoisuuden kuvastavan kilpirauhassairauksia. Tässä vaiheessa tutkimusmateriaali on hyvin pieni, ja lopullisten päätelmien tekeminen vaatii suurempaa tutkimusaineistoa. Monet tutkijat ovat pohtineet, että syljen metaboliittien tutkiminen diagnoosin tukemiseksi voi olla kliinisesti merkittävää. Biomarkkereiden avulla voidaan tutkia mm. ensimmäisiä merkkejä taudista tai taudin vakavuutta. Sylkitutkimuksissa ollaankin siirtymässä uudelle aikakaudelle. Perinteinen tutkimusasetelma, jossa tutkitaan yhtä proteiinia, geeniä tai metaboliittia kerrallaan, korvautuu globaalimmalla lähestymistavalla, jossa useampia metaboliitteja tai proteiineja tutkitaan samanaikaisesti. Useimpien biologisten tapahtumien takana on monitahoinen biologinen prosessi ja aineenvaihduntatuotteien kokonaisus. Teknologian kehittyessä tulevaisuuden visiona on automatisoitu sylkinäytteiden metaboliittianalyysi (metaboliittiprofiili), joka toimii diagnostiikan, hoidon seurannan ja lääkevaikutusten seurannan apuvälineenä. Lähteet 1. Oliveira Alves MG, Almeida JD, Balducci I, Guimarães Cabral LA. Oral lichen planus: A retrospective study of 110 Brazilian patients. BMC Res Notes 2010; 3: Stooper ET, Sollecito TP (2012). Oral lichen planus. CMAJ vol. 184 no Lavanya N, Jayanthi P (2011). Oral lichen planus: An update on pathogenesis and treatment. Journal of oral and maxofacial pathology Sugerman PB, Savage NW, Walsh LJ, Zhao ZZ (2002). The pathogenesis of oral lichen planus. CROMB July 2002 vol. 13 no

8 8 5. Shan B, Ashok L, Sujatha GP (2009). Evaluation of salivary cortisol and psychological factors in patients with oral lichen planus. Indian J Dent Res 2009 Jul- Sep;20(3): Kaufman E, Lamster IB. The diagnostic applications of saliva a Review. CROMB 2002;13: de Almeida Pdel V, Grègio AM, Machado MA, de Lima AA, Azevedo LR. Saliva compostitions and functions: A comprehensive Review. J Contemp Dent Prac 2008; 9: Rajiv G, Vijay K, Sardari L. Serum immunoglobulin levels in oral lichen planus. Indian J Dermat Vener Leprol 1994; 60: Wang Q, Gao P, Wang X (2014). The early diagnosis and monitoring of squamous cell carcinoma via saliva metabolomics. Sci Rep 2014 Oct 30;4: Zhang A, Sun H, Wang X (2012). Saliva Metabolomics Opens Door to Biomarker Discovery, Disease Diagnosis, and Treatment. Appl. Biochem Biotechnolog 2012 Nov;168(6) Tiziani S, Lopes V (2009). Early Stage Diagnosis of Oral Cancer Using 1H NMR- Based Metabolomics. Neoplasia 2009 Mar;11(3): Bista B. Nankova, Agarwal R, MacFabe D. et al. Enteric Bacterial Metabolites Propionic and Butyric Acid Modulate Gene Expression, Including CREB-Dependent Catecholaminergic Neurotransmission, in PC12 Cells - Possible Relevance to Autism Spectrum Disorders. PloS One 2014 Aug. 13. Mccoll S, Naccache P. et al. Propionic acid-induced calcium mobilization in human neutrophils. Journal of Cellular Physiology 07/1988, 136(1):

9 9 14. Schug Z, Peck B, Jonas D et al. Acetyl-CoA Synthetase 2 Promotes Acetate Utilization and Maintains Cancer Cell Growth under Metabolic Stress. Cancer cell 2015 Jan 12;27(1): Ragab A, Al-Mazroua M et al. Endogenous Ethanol Production Levels in Saudi Arabia Residents. Journal of Alchoholism and drug dependence 2015, 3: Yang L.L. Liu X.Q. Liu W. Cheng B. Li M.T. Comparative analysis of whole saliva proteomes for the screening of biomarkers for oral lichen planus. Inflamm Res. 2006;55: Bokor-Bratic M, Cankovic M, Dragnic N (2013). Unstimulated whole salivary flow rate and anxiolytics intake are independently associated with oral Candida infection in patients with oral lichen planus. Eur J Oral Sci 2013 Oct;121(5): Shah B, Ashok L, Sujatha GP. Evaluation of salivary cortisol and psychological factors in patients with oral lichen planus. Indian J Dent Res 2009 Jul-Sep;20(3): Agha-Hosseini F, Mirzaii-Dizgah I, Mikaili S, Abhollahi M. Increased salivary lipid peroxidation in human subjects with oral lichen planus. Int J Dent Hyg Nov;7(4): Kamodyová N, Tóthová L, Celec P. Salivary markers of oxidative stress and antioxidant status: influence of external factors. Dis Markers 2013;34(5): Vlková B, Stanko P, Minárik G, Tóthová L, Szemes T. Salivary markers of oxidative stress in patients with oral premalignant lesions. Arch Oral Biol Dec;57(12): Lopez-Jornet P, Martinez-Canocas A. Salivary biomarkers of oxidative stress and quality of life in patients with oral lichen planus. Geriatr Gerontol Int Jul;14(3):654-9.

10 Rai B, Kaur J, Jacobs R, Signh J. Possible action mechanism for curcumin in precancerous lseions based on serum and salivary markers of oxidative stress. J Oral Sci Jun;52(2): Zhang Y, Lin M, Zhang S, Wang Z. NF-κB-dependent cytokines in saliva and serum from patients with oral lichen planus: A study in an ethnic Chinese population. Cytokine 2008 Feb;41(2): Rhodus NL, Cheng B, Myers S. A comparison of the pro-inflammatory, NF-κBdependent cytokines: TNF-alpha, IL-1-alpha, IL-6, and IL-8 in different oral fluids from oral lichen planus patients. Clin Immunol Mar;114(3): Pezelj-Ribaric S, Prso IB, Abram M. Salivary levels of tumor necrosis factor-α in oral lichen planus. Mediators Inflamm Apr;13(2): Liu W-Z, He M-J, Long L. Interferon-γ and interleukin-4 detected in serum and saliva from patients with oral lichen planus. Int J Oral Sci Mar;6(1): Shirzad A, Pouramir M, Seyedmajidi M. Salivary total antioxidant capacity and lipid peroxidation in patients with erosive oral lichen planus. J Dent Res Dent Clin Dent Prospects Winter;8(1): Ghallab NA, El-Wakeel N, Shaker OG. Levels of salivary IFN-gamma, TNF-alfa, and TNF receptor-2 as prognostic markers in (erosive) oral lichen planus. Mediators of Inflammation Janardhanam SB, Prakasam S, Swaminathan VT. Differential expression of TLR-2 and TLR-4 in the epithelial cells in oral lichen planus. Arch Oral Biol May;57(5): Cheng Y-S L, Jordan L, Rees T. Levels of potential oral cancer salivary mrna biomarkers in oral cancer patients in remission and oral lichen planus patients. Clin Oral Investig Apr;18(3):

11 Shpitzer T, Hamzany Y, Bahar G, Feinmesser R. Salivary analysis of oral cancer biomarkers. Br J Cencer Oct 6;101(7): Shah B, Ashok L, Sujatha GP. Evaluation of salivary cortisol and psychological factors in patients with oral lichen planus. Indian J Dent Res 2009; 20: Girardi C, Luz C, Cherubinni K, de Figueiredo MA. Salivary cortisol and dehydroepiandrosterone (DHEA) levels, psychological factors in patients with oral lichen planus. Arch Oral Biol 2011: 56: Mikkonen JJW, Herrala M, Soininen P, et al. Metabolic profiling of saliva in patients of primary Sjögren s syndrome. Metabolomics 2013; 3: Navazesh M. Methods for collecting saliva. Ann NY Acad Sci 1993; 694: Yan SK, Wei BJ, et al. A metabolomic approach to the diagnosis of oral squamous cell carcinoma, oral lichen planus and oral leukoplakia. Oral oncol. 2008; 5: Siponen M, Huuskonen L, Läärä E, Salo T. Association of oral lichen planus with thyroid disease in a Finnish population: a retrospective case-control study. Oral Surg Oral Med Oral Path Oral Rad Endod 2010; 110: