Maxwell CSC RNA FFPE Kit

TEKNINEN OHJEKIRJA Maxwell CSC RNA FFPE Kit Tuotteen käyttöohjeet AS1360 Varoitus: Käsittele kasetteja varoen, tiivistereunat voivat olla teräviä. TUOTTEEN KÄYTTÖOHJEET AS1360 2800 Woods Hollow Rd. Madison, WI USA MDSS GmbH Schiffgraben 41 30175 Hannover, Germany Tarkistettu 10/18 TM404

Maxwell CSC RNA FFPE Kit Kaikki tekninen materiaali on saatavilla osoitteesta: www.promega.com/protocols/ Varmista sivustolta, että käytössäsi on tämän teknisen ohjekirjan uusin versio. Jos sinulla on kysyttävää järjestelmän käytöstä, lähetä sähköpostia Promegan tekniseen tukeen osoitteeseen techserv@promega.com. 1. Kuvaus... 1 2. Tuotteen osat, säilytysolosuhteet ja symbolien selitykset... 2 3. Tuotteen käyttötarkoitus... 4 4. Tuotteen käyttörajoitukset... 4 5. Ennen aloittamista... 5 5.A. FFPE-näytteiden valmisteleminen... 5 5.B. Maxwell CSC Cartridge -kasetin valmisteleminen... 6 6. Instrumenttiajo... 8 7. Puhdistamisen jälkeen... 10 8. Vianmääritys... 10 9. Liite... 12 9.A. Ribonukleaasivapaan ympäristön luominen... 12 9.B. Viite... 12 10. Yhteenveto muutoksista... 12 Maxwell CSC RNA FFPE Kit on saatavilla vain tietyissä maissa. Tuote täyttää in vitro -diagnostiikkaan tarkoitetuista lääkinnällisistä laitteista annetun EU-direktiivin 98/79/EY olennaiset vaatimukset. 1. Kuvaus Maxwell CSC RNA FFPE Kit -sarjaa käytetään yhdessä Maxwell CSC Instrumentin kanssa, ja se tarjoaa helpon menetelmän RNA:n tehokkaaseen ja automatisoituun puhdistamiseen formaliinifiksoidusta parafiiniin valetuista (FFPE) rinnan, keuhkon tai paksusuolen ihmiskudosnäytteistä. Maxwell CSC Instrumentissa on esiohjelmoidut puhdistusmenetelmät. Se on tarkoitettu käytettäväksi sarjan mukana toimitettavien valmiiksi annosteltujen reagenssikasettien ja lisäreagenssien kanssa, joiden ansiosta käyttö on helppoa ja vaivatonta. Instrumentti voi käsitellä jopa 16 näytettä alle 60 minuutissa, ja puhdistettua RNA:ta voidaan käyttää suoraan useissa monistamisen perustuvissa alavirtamenetelmissä, kuten RT-PCR:ssä. Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison, WI 53711-5399 USA Maksuton puhelinnumero Yhdysvalloissa: 800-356-9526 608-274-4330 Faksi: 608-277-2516 1 www.promega.com TM404 Tarkistettu 10/18

1. Kuvaus (jatkoa) Maxwell CSC RNA FFPE Kit puhdistaa nukleiinihapon käyttämällä paramagneettisia partikkeleita, jotka mahdollistavat liikkuvan kiinteän faasin ja optimoivat näin RNA-näytteenoton ja -puhdistamisen. Maxwell CSC Instrument on magneettinen partikkelikäsittelyinstrumentti. Järjestelmä mahdollistaa RNA:n tehokkaan sitomisen paramagneettisiin partikkeleihin esitäytetyn kasetin ensimmäisessä näytesyvennyksessä ja siirtää näytteen kasetin näytesyvennysten läpi ja sekoittaa sen käsittelyn aikana. Tällä magneettisella näytteenottotavalla vältetään yleiset nestekäsittelyjärjestelmiin liittyvät ongelmat, kuten näytteenottokärkien tukkeutuminen tai vaillinaiset reagenssisiirrot, jotka ovat haittana muissa yleisesti käytetyissä automaattijärjestelmissä ja johtavat siihen, että näyte ei puhdistu optimaalisesti. 2. Tuotteen osat, säilytysolosuhteet ja symbolien selitykset TUOTE KOKO LUETTELONUMERO Maxwell CSC RNA FFPE Kit 48 preparointia AS1360 Tarkoitettu in vitro -diagnostiseen käyttöön. Vain ammattikäyttöön. Riittää 48 automatisoituun eristämiseen FFPE-näytteistä. Maxwell CSC Cartridges -kasetit ovat kertakäyttöisiä. 15 C 30 C 6010TB 48 Sisältö: 25ml Mineral Oil 20ml Lysis Buffer 2 1ml Proteinase K 100µl Blue Dye 2 1ml MnCl 2, 0.09M 1ml DNase Buffer 3 vials DNase I (lyophilized) 48 Maxwell FFPE Cartridges 50 CSC/RSC Plungers 50 Elution Tubes (0.5ml) 25ml Nuclease-Free Water Säilytysolosuhteet: Säilytä Maxwell CSC RNA FFPE Kit huoneenlämpötilassa (15 30 C). Säilytä uudelleen hydratoitu deoksiribonukleaasi I 10... 30 C:n lämpötilassa. Älä pakasta ja sulata yli 10 kertaa. Turvallisuustiedot: Reagenssikasetit sisältävät etanolia ja isopropanolia. Nämä aineet ovat helposti syttyviä, haitallisia ja ärsyttäviä. 2 Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison, WI 53711-5399 USA Maksuton puhelinnumero Yhdysvalloissa: 800-356-9526 608-274-4330 Faksi: 608-277-2516 TM404 Tarkistettu 10/18 www.promega.com

Maxwell CSC Cartridges -kasetit on tarkoitettu käytettäväksi mahdollisesti tartuntavaarallisten aineiden kanssa. Käytä asianmukaisia henkilösuojaimia (kuten käsineitä ja suojalaseja) käsitellessäsi tartuntavaarallisia aineita. Kun tämän järjestelmän kanssa käytetään tartuntavaarallisia aineita, niiden käsittelyssä ja hävittämisessä on noudatettava laitoksessasi voimassa olevaa ohjeistusta. Varoitus: Käsittele kasetteja varoen, tiivistereunat voivat olla teräviä. Muut tiedot: Maxwell CSC RNA FFPE Kitin osat on testattu ja todettu laadunvalvontatesteissä yhteensopiviksi. Eri sarjaerien osia ei ole suositeltavaa sekoittaa keskenään. Käytä vain sarjan mukana tulleita osia. Symbolien selitykset Symboli Selitys Symboli Selitys In vitro -diagnostiikkaan tarkoitettu lääkinnällinen laite Euroopan yhteisössä toimiva valtuutettu edustaja 15 C 30 C Säilytettävä 15 30 C:n lämpötilassa. 2800 Woods Hollow Rd. Madison, WI USA Valmistaja Varoitus Ärsyttävä Karsinogeeninen Lukumäärä n testiin Conformité Européenne Varoitus. Biologinen riski. Varoitus. Puristumisvaara. Luettelonumero Eräkoodi Kertakäyttöinen Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison, WI 53711-5399 USA Maksuton puhelinnumero Yhdysvalloissa: 800-356-9526 608-274-4330 Faksi: 608-277-2516 3 www.promega.com TM404 Tarkistettu 10/18

3. Tuotteen käyttötarkoitus Maxwell CSC RNA FFPE Kit on tarkoitettu käytettäväksi yhdessä Maxwell CSC Instrumentin ja Maxwell CSC FFPE RNA -puhdistusmenetelmän kanssa in vitro -diagnostisena (IVD) lääkinnällisenä laitteena, jolla RNA:ta eristetään automatisoidusti formaliinifiksoidusta parafiiniin valetuista FFPE rinnan, keuhkon tai paksusuolen ihmiskudosnäytteistä. Puhdistettu RNA soveltuu käytettäväksi monistamiseen perustuvissa in vitro -diagnostisissa kokeissa. Maxwell CSC RNA FFPE Kit on tarkoitettu käytettäväksi 15 30 C:n lämpötilassa. Jos sitä käytetään näiden lämpötilarajojen ulkopuolella, saatavat tulokset eivät välttämättä ole optimaalisia. Maxwell CSC RNA FFPE Kitin kanssa voidaan käyttää FFPE-näytteitä, jotka on preparoitu käyttämällä 10-prosenttista neutraalipuskuroitua formaliinia. Maxwell CSC RNA FFPE Kit -sarjaa ei ole tarkoitettu käytettäväksi osana erityistä diagnostista testiä. Maxwell CSC RNA FFPE Kit on tarkoitettu vain ammattikäyttöön. Diagnostisia tuloksia, jotka on saatu käyttämällä tällä järjestelmällä puhdistettua RNA:ta, ei saa tulkita yhdessä muiden kliinisten tai laboratoriotietojen kanssa. 4. Tuotteen käyttörajoitukset Maxwell CSC RNA FFPE Kit on tarkoitettu käytettäväksi ainoastaan FFPE-ihmiskudosnäytteiden kanssa, jotka on otettu rinnasta, keuhkosta tai paksusuolesta. Sitä ei ole tarkoitettu käytettäväksi muiden kuin FFPEkudosnäytteiden kanssa, kuten tuoreiden tai jäädytettyjen kudosnäytteiden kanssa tai FFPE-näytteiden kanssa, jotka on otettu muista kuin ihmisen rinta-, keuhko- tai paksusuolikudoksista. Maxwell CSC RNA FFPE Kit -sarjaa ei ole tarkoitettu käytettäväksi muuntyyppisten näytteiden kanssa, mukaan lukien muut kuin ihmisistä otetut näytteet, eikä DNA:n puhdistamiseen. Maxwell CSC RNA FFPE Kit -sarjaa ei ole tarkoitettu käytettäväksi kudosnäytteiden kanssa, jotka on preparoitu muilla fiksatiiveilla kuin 10-prosenttinen neutraalipuskuroitu formaliini. Maxwell CSC RNA FFPE Kitin suorituskyky on arvioitu eristämällä RNA:ta FFPE-kudosnäytteistä, jotka ovat olleet kooltaan 0,1 2,0 mm 3. Sitä ei ole tarkoitettu käytettäväksi näiden rajojen ulkopuolella olevien näytteiden kanssa. Käyttäjän vastuulla on selvittää suorituskykyominaisuudet, joita tarvitaan alavirran puoleisissa diagnostiikkasovelluksissa. Asianmukaiset kontrollit on sisällytettävä kaikkiin alavirran puoleisiin diagnostiikkasovelluksiin, joissa käytetään Maxwell CSC RNA FFPE Kit -sarjalla puhdistettua RNA:ta. 4 Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison, WI 53711-5399 USA Maksuton puhelinnumero Yhdysvalloissa: 800-356-9526 608-274-4330 Faksi: 608-277-2516 TM404 Tarkistettu 10/18 www.promega.com

5. Ennen aloittamista Käyttäjällä on oltava seuraavat tarvikkeet: mikrosentrifugi pipettejä ja pipetinkärkiä näytteiden esikäsittelyä ja siirtoa varten esitäytettyihin reagenssikasetteihin 1,5 2,0 ml:n putkia näytteiden inkubointia varten (esim. 1,5 ml:n Microtubes-putkia: luettelonumero V1231) 56 C:n ja 80 C:n lämpötilaan asetetut lämpöblokit. (Huomautus: Lämpöblokki on asetettava vaadittuun lämpötilaan. Lämpöblokin lämpötila on mitattava käyttämällä kalibroitua lämpömittaria. Varmista, että lämpötila on lämpömittarin virhemarginaalien sisällä.) FFPE-näytteet, joiden kokonaiskudosmäärä on 0,1 2,0 mm 3 ; leikkeen paksuus ei saa olla yli 5 µm (Huomautus: Näytteet on säilytettävä huoneenlämpötilassa [15 30 C].) partateriä (Huomautus: Noudata varovaisuutta käyttäessäsi partateriä näytteen kaapimiseen levystä.) Rekonstituoi tarvittaessa kylmäkuivattu deoksiribonukleaasi I -ampulli 275 µl:lla nukleaasivapaata vettä. Käännä ampulli ylösalaisin, jotta deoksiribonukleaasi I irtoaa korkin alapuolesta, ja sekoita pyörittämällä kevyesti. Älä sekoita pyörresekoittimessa. 5.A. FFPE-näytteiden valmisteleminen Leikenäytteiden esikäsittely 1. Aseta leike 1,5 ml:n mikrosentrifugiputkeen. Jos käytät levyyn kiinnitettyjä kudosleikkeitä, kaavi leike irti levystä käyttämällä puhdasta partaterää. 2. Lisää näyteputkiin 300 µl mineraaliöljyä. Sekoita pyörresekoittimessa 10 sekuntia. 3. Lämmitä näytteitä 80 C:n lämpötilassa 2 minuutin ajan. Aseta näytteet huoneenlämpötilaan pääsekoituksen valmistamisen ajaksi. 4. Valmista pääsekoitus hajotuspuskurista, proteinaasi K:sta ja sinisestä väriaineesta alla olevan ohjeen mukaisesti: Reagenssi Määrä/reaktiot Reaktiot (Ajettava määrä +1) Yhteensä Hajotuspuskuri 224 µl n+1 224 µl (n+1) Proteinaasi K 25 µl n+1 25 µl (n+1) Sininen väriaine 1 µl n+1 1 µl (n+1) 5. Lisää 250 µl pääsekoitusta jokaiseen näyteputkeen ja sekoita pyörresekoittimessa 5 sekuntia. 6. Erota kerrokset sentrifugoimalla näyteputkia nopeudella 10 000 g 20 sekunnin ajan. Jos vesikerroksessa (alempi, sininen kerros) on sakkaa, dispergoi se sekoittamalla varovaisesti. Jätä molemmat faasit putkeen. 7. Siirrä näyteputket 56-asteiseen lämpöblokkiin ja inkuboi 15 minuuttia. 8. Siirrä näyteputket 80-asteiseen lämpöblokkiin ja inkuboi 1 tunti. 9. Poista näyteputket lämpöblokista ja anna näytteiden jäähtyä huoneenlämpötilaan 15 minuutin ajan. Valmista näytteiden jäähtyessä deoksiribonukleaasiseos vaiheen 10 ohjeiden mukaisesti. Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison, WI 53711-5399 USA Maksuton puhelinnumero Yhdysvalloissa: 800-356-9526 608-274-4330 Faksi: 608-277-2516 5 www.promega.com TM404 Tarkistettu 10/18

5.A. FFPE-näytteiden valmisteleminen (jatkoa) 10. Valmista MnCl 2 :sta, deoksiribonukleaasipuskurista ja deoksiribonukleaasi I:stä seos seuraavassa järjestyksessä: Reagenssi 1 Määrä/reaktiot Reaktiot (Ajettava määrä +1) Yhteensä MnCl 2, 0,09 M 26 µl n+1 26 µl (n+1) Deoksiribonukleaasipuskuri 2 14 µl n+1 14 µl (n+1) Deoksiribonukleaasi I 3 10 µl n+1 10 µl (n+1) 1 Jos deoksiribonukleaasiseoksen reagenssit lisätään näyteputkiin yksittäin, huolehdi, että lisäät ne edellä esitetyssä järjestyksessä. Lisää jokainen reagenssi pipetoimalla huolellisesti ennen seuraavan reagenssin lisäämistä. 2 Säilytä deoksiribonukleaasipuskuri 15 30 C:n lämpötilassa. Alhaisemmissa säilytyslämpötiloissa se voi saostua. Jos puskurissa on sakkaa, liuota se lämmittämällä puskuria 56 C:ssa 2 minuuttia ja sekoittamalla sen jälkeen lyhyesti pyörresekoittimessa. 3 Säilytä jäljelle jäävä rekonstituoitu deoksiribonukleaasi I 30... 10 C:n lämpötilassa. 11. Lisää jokaiseen näyteputkeen 50 µl deoksiribonukleaasiseosta. Sekoita pipetoimalla 10 kertaa. 12. Inkuboi näyteputkia 15 minuuttia huoneenlämmössä (15 30 C). 13. Sentrifugoi näyteputkia täydellä nopeudella mikrosentrifugissa 5 minuutin ajan. 14. Siirrä sininen vesifaasi välittömästi Maxwell CSC Cartridge -kasetin syvennykseen 1. Katso kasetin valmisteluohjeet kohdasta 5.B. 5.B. Maxwell CSC Cartridge -kasetin valmisteleminen 1. Vaihda käsineet ennen Maxwell CSC Cartridges -kasettien, CSC/RSC-ruiskujen ja eluutioputkien käsittelemistä. Kasetit asetetaan Maxwell CSC Deck Tray -tarjottimelle instrumentin ulkopuolelle, minkä jälkeen kasetit ja näytteet sisältävä tarjotin siirretään instrumenttiin puhdistamista varten. Aseta käytettävät kasetit Maxwell CSC Deck Tray -tarjottimeen (kuva 2). Aseta jokainen kasetti tarjottimeen siten, että syvennys 1 (kasetin suurin näytesyvennys) on kauimpana eluutioputkista. Paina kasettia alas, kunnes se napsahtaa paikoilleen. Varmista, että kasetin kumpikin pää on kokonaan paikoillaan tarjottimessa. Poista tiiviste vetämällä varovaisesti taaksepäin niin, että koko tiiviste irtoaa kasetin päältä. Huolehdi, että koko tiivistenauha ja liimajäämät on poistettu kasetista. Varoitus: Käsittele kasetteja varoen. Tiivistereunat voivat olla teräviä. 2. Aseta yksi ruisku jokaisen kasetin syvennykseen 8. Huomautus: Käytä ainoastaan Maxwell CSC RNA FFPE Kitin mukana toimitettuja ruiskuja. Maxwell 16 LEV- ja SEV Kit -sarjojen ruiskut eivät ole yhteensopivia Maxwell CSC Instrumentin kanssa. 6 Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison, WI 53711-5399 USA Maksuton puhelinnumero Yhdysvalloissa: 800-356-9526 608-274-4330 Faksi: 608-277-2516 TM404 Tarkistettu 10/18 www.promega.com

3. Aseta tyhjä eluutioputki jokaisessa Maxwell CSC Deck Tray -tarjottimen kasetissa olevaan eluutioputkelle tarkoitettuun paikkaan. Huomautus: Käytä ainoastaan Maxwell CSC RNA FFPE Kitin mukana toimitettuja eluutioputkia. Muut eluutioputket eivät välttämättä ole yhteensopivia Maxwell CSC Instrumentin kanssa ja voivat vaikuttaa RNA-puhdistuksen tuloksiin. 4. Lisää jokaisen eluutioputken pohjalle 50 μl nukleaasivapaata vettä. Eluutioputkien on oltava auki RNApuhdistuksen aikana. Huomautus: Käytä ainoastaan Maxwell CSC RNA FFPE Kitin mukana toimitettua nukleaasivapaata vettä. Muiden eluutiopuskurien käyttäminen voi vaikuttaa RNA-puhdistuksen tuloksiin tai alavirtakäyttöön. Maxwell FFPE Cartridge -kasetin valmistelemista koskevat huomautukset 1. Jos käsiteltäviä näytteitä on alle 16, aseta kasetit tarjottimen keskelle. 2. Puhdista näyte- tai reagenssitahrat Maxwell CSC Deck Tray -tarjottimen osista Maxwell CSC Instrument Manual-käyttöohjeiden mukaisesti. Älä käytä instrumentin minkään osan puhdistamiseen valkaisuainetta. 1 2 3 4 5 6 7 8 1. Sidosliuos 2. Magneettiset partikkelit 3. Pesuliuos 4. Pesuliuos 5. Pesuliuos 6. Pesuliuos 7. Tyhjä 8. Tyhjä 11339TC Syvennykset, joiden sisällön käyttäjä lisää 1. Esikäsitellyt näytteet 8. CSC/RSC-ruisku Kuva 1. Maxwell CSC Cartridge -kasetti. Kuvassa näkyy kasetin sisältö. Esikäsitelty FFPE-näyte lisätään syvennykseen 1 ja ruisku syvennykseen 8. 10828TB Kuva 2. Maxwell CSC Deck Tray -tarjottimen asettelu ja kokoonpano. Nukleaasivapaa vesi lisätään eluutioputkiin kuvan mukaisesti. Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison, WI 53711-5399 USA Maksuton puhelinnumero Yhdysvalloissa: 800-356-9526 608-274-4330 Faksi: 608-277-2516 7 www.promega.com TM404 Tarkistettu 10/18

6. Instrumenttiajo Maxwell CSC RNA FFPE -menetelmän voi ladata Promegan sivustolta osoitteesta: www.promega.com/ resources/tools/maxwellcscmethod. Katso tarkemmat tiedot Maxwell CSC Methods Installation Technical Manual #TM401 -ohjekirjasta. Jos epäilet, että instrumenttisi on kontaminoitunut ribonukleaasilla, puhdista instrumentti ennen sen ajamista käyttämällä esimerkiksi Steris LpH -pesuainetta. Noudata Maxwell CSC Instrument Operating Manualkäyttöohjeen puhdistamista ja huoltoa koskevassa kappaleessa annettuja ohjeita. 1. Kytke Maxwell CSC Instrument ja tablettitietokone päälle. Instrumentin käyttöliittymä käynnistyy automaattisesti, ja instrumentti tekee itsetarkastuksen ja palauttaa kaikki liikkuvat osat alkuasentoon. 2. Valitse aloitusnäytöstä Käynnistä. 3. Valitse ajossa käytettävä menetelmä automaattisesti skannaamalla tai kirjoittamalla Maxwell CSC RNA FFPE Kitin etiketissä oleva menetelmän viivakoodi (kuva 3). Huomautus: Maxwell CSC RNA FFPE Kit -menetelmän viivakoodi edellytetään tehtäessä RNA-puhdistus Maxwell CSC Instrumentilla. Sarjan etiketissä on kaksi viivakoodia. Menetelmän viivakoodi näkyy merkittynä kuvassa 3. Jos viivakoodia ei pysty skannaamaan, ota yhteyttä Promegan tekniseen tukeen. 12053TA Kuva 3. Sarjan etiketti, jossa näkyy skannattava menetelmän viivakoodi. Punaisessa laatikossa näkyy sarjan etiketissä oleva menetelmän viivakoodi, jonka skannaaminen käynnistää puhdistusajon. 4. Valitse ajettavat kasettipaikat (katso Maxwell CSC Instrument Operating Manual), ja skannaa tai syötä käsin tarpeelliset näyteseurantatiedot. Poista valinta käyttämättömistä paikoista. Valitse Jatka, kun kaikki näytetiedot on annettu. 5. Varmista tablettitietokoneesta, että näytteet on lisätty kasettien syvennykseen 1 (kohdan 5.A mukaisesti), että kasetit on ladattu instrumenttiin, että 50 μl nukleaasivapaata vettä sisältävät eluutioputket ovat paikallaan ja auki ja että ruiskut on asetettu syvennykseen 8. 8 Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison, WI 53711-5399 USA Maksuton puhelinnumero Yhdysvalloissa: 800-356-9526 608-274-4330 Faksi: 608-277-2516 TM404 Tarkistettu 10/18 www.promega.com

6. Siirrä valmistellut kasetit sisältävä Maxwell CSC Deck Tray -tarjotin Maxwell CSC Instrumentin alustalle. Varmista, että tarjotin on asetettu Maxwell CSC Instrumenttiin siten, että eluutioputket ovat lähimpänä luukkua. Tarjotin mahtuu instrumenttiin vain tässä suunnassa. Jos tarjottimen saamisessa alustaan on vaikeuksia, tarkista, että se on oikeassa suunnassa. Varmista, että tarjotin on tasaisesti instrumenttialustassa. Huomautus: Pidä Maxwell CSC Deck Tray -tarjotinta kiinni sivuista, jotta kasetit eivät siirry paikoiltaan telineestä. Varoitus: Puristumisvaara. 7. Varmista, että kaikki tarpeellinen esikäsittely on tehty, ja kosketa Käynnistä-painiketta, jolloin instrumentin luukku sulkeutuu ja käsittely alkaa. 8. Maxwell CSC Instrument aloittaa puhdistusajon välittömästi. Näytössä näkyvät suoritetut vaiheet ja jäljellä oleva arvioitu ajoaika. Huomautus: Jos ajo keskeytetään ennen sen päättymistä, instrumentti pesee hiukkaset pois ruiskuista ja tyhjentää ruiskut kasetin syvennykseen 8. Näytteet menetetään. Älä yritä puhdistaa uudestaan näytteitä, joiden instrumenttiajo keskeytettiin. 9. Kun automatisoitu puhdistusajo on valmis, tablettitietokoneen näyttöön tulee menetelmän päättymisestä ilmoittava viesti: Ajo päättyi. Ajon päätyttyä 10. Avaa luukku noudattamalla näytön ohjeita menetelmän loputtua. Varmista, että ruiskut ovat kasetin syvennyksessä 8 ajon päätyttyä. Poista tarjotin instrumentista ja poista eluoidut näytteet tarjottimelta. Jos kaikkia ruiskuja ei ole poistettu ruiskupalkista, tee puhdistus noudattamalla näytön kehotteita, kun kyseessä on keskeytetty ajo, tai poista jäljellä olevat ruiskut valitsemalla asetusnäytöstä puhdistus, kun kyseessä on loppuun asti tehty ajo. 11. Aseta RNA:n sisältäviin eluutioputkiin korkit ja poista ne välittömästi ajon jälkeen, jotta eluaatit eivät pääse haihtumaan. Poista Maxwell CSC Deck Tray -tarjotin instrumentista. Huomautus: Poista teline instrumentin alustasta pitämällä telineestä kiinni sen sivuista. Varmista, että näytteet on poistettu instrumentista ennen UV-desinfioinnin tekemistä, jotta puhdistettu nukleiinihappo ei vahingoitu. RNA-näytteitä voidaan säilyttää yön yli 30... 10 C:n lämpötilassa tai pidempään alle 60 C:ssa. 12. Poista kasetit ja ruiskut Maxwell CSC Deck Tray -tarjottimesta ja hävitä ne vaarallisena jätteenä laitoksesi käytäntöjen mukaisesti. Kasetit, ruiskut ja eluutioputket ovat kertakäyttöisiä. Älä käytä uudelleen Maxwell CSC Cartridges -kasetteja, CSC/RSC-ruiskuja tai eluutioputkia. Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison, WI 53711-5399 USA Maksuton puhelinnumero Yhdysvalloissa: 800-356-9526 608-274-4330 Faksi: 608-277-2516 9 www.promega.com TM404 Tarkistettu 10/18

7. Puhdistamisen jälkeen Varmista, että puhdistetun RNA-näytteen tulos ja puhtaus vastaavat alavirran puoleisen diagnostisen kokeen syötevaatimuksia ennen kuin käytät sitä kyseisessä kokeessa. Sarjan suorituskyky arvioitiin monistuskelpoisen RNA:n puhdistuksen pohjalta. Muut määrityskeinot, absorbanssi tai fluoresoivalla väriaineella sitominen mukaan lukien, eivät välttämättä korreloi monistamisen kanssa (1). FFPE-näytteiden absorbanssilukemat saattavat yliarvioida tuloksen, siksi suosittelemme käyttämään tuloksen määrittelemiseen täsmällisempiä menetelmiä (1). 8. Vianmääritys Jos sinulla on kysymyksiä, joihin ei ole annettu vastausta tässä, ota yhteyttä Promegan paikalliseen sivutoimipisteeseen tai jälleenmyyjään. Yhteystiedot ovat osoitteessa: www.promega.com. Sähköposti: techserv@promega.com Oireet RNA:n pitoisuus eluaatissa odotettua alhaisempi (Tyypillisen FFPE-leikkeen pitäisi tuottaa monistuskelpoinen RNA riippuen kudoksen koosta, solujen määrästä ja tyypistä, formaliinikiinnityksen kunnosta ja käsittelystä.) Syyt ja kommentit Sarjan suorituskyky on arvioitu eristämällä RNA:ta FFPEkudosnäytteistä, jotka ovat olleet kooltaan 0,1 mm 3-2,0 mm 3. Sitä ei ole tarkoitettu näiden rajojen ulkopuolella oleville näytteille. Käytä näiden rajojen sisällä olevia leikkeitä. Sarja on tarkoitettu käytettäväksi FFPE-ihmiskudosnäytteiden kanssa, jotka on otettu rinnasta, keuhkosta tai paksusuolesta. Sitä ei ole tarkoitettu käytettäväksi muiden kuin FFPE-kudosnäytteiden kanssa, kuten tuoreiden tai jäädytettyjen kudosnäytteiden kanssa tai FFPE-näytteiden kanssa, jotka on otettu muista kuin ihmisen rinta-, keuhko- tai paksusuolikudoksista. Inkubointiajat ja -lämpötilat on testattu vain ihmisen rinnan, keuhkon ja paksusuolen osalta. Käytä ainoastaan ihmisen rinta-, keuhko- tai paksusuolinäytteisiin. Sarjaa ei ole tarkoitettu käytettäväksi kudosnäytteiden kanssa, jotka on preparoitu muilla fiksatiiveilla kuin 10-prosenttinen neutraalipuskuroitu formaliini. Varmista, että muita fiksatiiveja ei ole käytetty. Ribonukleaasit on saatettu lisätä näytteiden käsittelyn tai määrittelyn aikana. Katso ohjeet ribonukleaasivapaan ympäristön luomisesta kappaleesta 9. Käytetty kudos oli tahriintuneesta levystä tai leikkeestä. Tahriintuneista levyistä tai leikkeistä ei esitetä väitteitä. Toista puhdistus tahriintumattomalla levyllä tai leikkeellä. Sarjan suorituskyky arvioitiin monistuskelpoisen RNA:n puhdistuksen pohjalta. Muut määrityskeinot, absorbanssi tai fluoresoivalla väriaineella sitominen mukaan lukien, eivät välttämättä korreloi monistamisen kanssa. Arvioi tulos käyttämällä monistusmääritysmenetelmää. 10 Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison, WI 53711-5399 USA Maksuton puhelinnumero Yhdysvalloissa: 800-356-9526 608-274-4330 Faksi: 608-277-2516 TM404 Tarkistettu 10/18 www.promega.com

8. Vianmääritys (jatkoa) Oireet Laatu odotettua heikompi (Eluaatti sisältää erittäin fragmentoitunutta RNA:ta tai alavirran puoleisten kokeiden inhibiittoreita.) Eluaateissa on DNA:ta. (Eluaatit ovat kontaminoituneet DNA:lla, mikä saattaa haitata alavirran puoleisia kokeita.) Syyt ja kommentit Formaliinikiinnitys ja siitä seuraava silloittumisen purkautuminen fragmentoi RNA:n. Jos RNA on fragmentoitunut ennen eristystä/ puhdistamista, fragmentoitunut RNA puhdistuu tällä sarjalla. Selvitä, onko ongelma valitussa leikkeessä vai käsittelyssä, toistamalla puhdistus vierekkäisellä leikkeellä. Tietyt monistuskokeet ovat erityisen herkkiä inhibiittoreiden läsnäololle. Alavirran puoleisten kokeiden kontrollien pitäisi tunnistaa, jos eluaatissa on monistuksen inhibiittori. Käyttäjän vastuulla on varmistaa tämän tuotteen yhteensopivuus kaikkien alavirran puoleisten kokeiden kanssa. Näytteeseen lisätty deoksiribonukleaasiseos aiheuttaa liiallista deoksiribonukleaasin aktiivisuutta, kun sitä käytetään FFPEkudosnäytteisiin kooltaan 0,1 2,0 mm 3. Sitä ei ole tarkoitettu näiden rajojen ulkopuolella oleville näytteille, ja se ei välttämättä toimi niiden kanssa optimaalisesti. Käytä näiden rajojen sisällä olevia leikkeitä. Jos deoksiribonukleaasiseosta ei sekoiteta riittävästi näytteeseen esikäsittelyn aikana, seurauksena voi olla DNA:n puutteellinen hajoaminen. Sekoita deoksiribonukleaasiseos huolellisesti näytteeseen. Jos deoksiribonukleaasiseoksen osat lisätään näytteeseen erikseen, huolehdi, että lisäät ne kappaleen 5.A vaiheessa 10 esitetyssä järjestyksessä. Huolehdi myös, että jokainen ainesosa sekoitetaan huolellisesti lisäyksen yhteydessä. Jos ainesosat lisätään eri järjestyksessä tai niitä ei sekoiteta kunnolla, tämä voi tehdä deoksiribonukleaasin tehottomaksi. Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison, WI 53711-5399 USA Maksuton puhelinnumero Yhdysvalloissa: 800-356-9526 608-274-4330 Faksi: 608-277-2516 11 www.promega.com TM404 Tarkistettu 10/18

9. Liite 9.A. Ribonukleaasivapaan ympäristön luominen Ribonukleaasien tekeminen tehottomaksi on erittäin vaikeaa. Varo lisäämästä ribonukleaasiaktiivisuutta RNAnäytteisiin eristämisen aikana ja sen jälkeen. Tämä on erityisen tärkeää, jos aloitusmateriaalia on saatavilla vain rajallisesti. Seuraavat huomiot voivat auttaa estämään näytteiden tahatonta kontaminoitumista ribonukleaasilla. 1. Kaksi yleisintä ribonukleaasikontaminaation lähdettä ovat käyttäjän kädet ja bakteerit tai homeet, joita ilmassa leijuvissa pölyhiukkasissa voi olla. Estääksesi näiden aiheuttaman kontaminaation käytä aseptista tekniikkaa, kun käsittelet tämän järjestelmän mukana toimitettuja reagensseja. Käytä aina käsineitä. Vaihda käsineet aina, kun kosketus ribonukleaaseihin on saattanut tapahtua. 2. Käytä RNA:n käsittelyssä aina kun mahdollista steriilejä ja kertakäyttöisiä muovitarvikkeita. Nämä materiaalit ovat yleensä ribonukleaasivapaita eivätkä edellytä esikäsittelyä ribonukleaasin inaktivoimiseksi. 3. Varmista, että ei-steriilit lasi- ja muovitarvikkeet ovat ribonukleaasivapaita, käsittelemällä ne ennen käyttöä. Kuumenna lasitarvikkeita uunissa 200 C:ssa yön yli ja huuhtele muovitarvikkeet huolellisesti 0,1 N NaOH:lla, 1 mm EDTA:lla ja sen jälkeen ribonukleaasivapaalla vedellä. Voit käyttää myös kaupallisesti myytäviä ribonukleaasin poistotuotteita noudattamalla valmistajan ohjeita. 4. Käsittele muut kuin järjestelmän mukana toimitetut liuokset lisäämällä dietyylipyrokarbonaattia (DEPC) 0,1 % vetokaapissa. Inkuboi yön yli sekoittamalla huoneenlämmössä kaapissa. Poista DEPC-jäämät autoklaavaamalla 30 minuuttia. Varoitus: DEPC on mahdollinen karsinogeeni, ja sitä on käytettävä ainoastaan kemiallisessa vetokaapissa. DEPC reagoi nopeasti amiinien kanssa, ja sitä ei voi käyttää Tris-puskurien käsittelemiseen. Huomautus: Kaikissa alavirtamenetelmissä on olennaisen tärkeää, että suojaat aina RNA-näytteet ribonukleaaseilta. 9.B. Viite 1. Bonin, S. et al. (2010) Multicentre validation study of nucleic acids extraction from FFPE tissues. Virchows Arch. 457, 309 17. 10. Yhteenveto muutoksista Tämän asiakirjan korjattuun versioon 10/18 tehtiin seuraava muutos: 1. Asiakirja päivitettiin lisäämällä siihen in vitro -diagnostiikasta annetun EU-direktiivin (98/79/EY) vaatimukset. 12 Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison, WI 53711-5399 USA Maksuton puhelinnumero Yhdysvalloissa: 800-356-9526 608-274-4330 Faksi: 608-277-2516 TM404 Tarkistettu 10/18 www.promega.com

2013 8 Promega Corporation. Kaikki oikeudet pidätetään. Maxwell on Promega Corporationin rekisteröity tavaramerkki. Tuotteilla saattaa olla haettuja tai myönnettyjä patentteja, tai niillä saattaa olla tiettyjä rajoituksia. Lisätietoja on Promegan verkkosivustolla. Kaikkiin hintoihin ja tietoihin voidaan tehdä muutoksia ilman erillistä ilmoitusta. Valmistetta koskeviin väittämiin voidaan tehdä muutoksia. Ajantasaisimmat tiedot Promega-tuotteista saat Promegan online-luettelosta tai ottamalla yhteyttä Promegan tekniseen tukeen. Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison, WI 53711-5399 USA Maksuton puhelinnumero Yhdysvalloissa: 800-356-9526 608-274-4330 Faksi: 608-277-2516 13 www.promega.com TM404 Tarkistettu 10/18