( B ) KUULUTUSJULKA I SUU UTLAGGNI NG S SKR I FT 81262 C ) (51) Kv.lk.5 - Int.c1.5 1 A 61K 39/10, C 07K 3/12 (21) Patenttihakemus - Patentansökning 851859 SUOMI-FINLAND (FI) Patentti- ja rekisterihallitus Patent- och registerstyrelsen (22) Hakemispäivä - Ansökningsdag 10.05.85 (24) Alkupäivä - Löpdag 10.05.85 (41) Tullut julkiseksi - Blivit offentlig 13.11.85 (44) Nähtäväksipanon ja kuul.julkaisun pvm. - Ansökan utlagd och utl.skriften publicerad 29.06.90 (32) (33) (31) Etuoikeus - Prioritet 12.05.84 GB 8412207 P (71) Hakija - Sökande 1. The Wellcome Foundation United, 183-193 Euston Road, London, United Kingdom, (GB) (72) Keksijä - Uppfinnare 1. Novotny, Pavel, Langley Court, Beckenham, Kent, United Kingdom, (GB) (74) Asiamies - Ombud: Oy Kolster Ab (54) Keksinnön nimitys - Uppfinningens benämning Menetelmä adenylaatti-syklaasi-aktiivisuuteen liittyvän anti geenipreparaatin eristämiseksi Bordetella pertussisbakteerista Förfarande för isolering av ett med adenylat-cyklas-aktivitet associerat antigenpreparat ur bakterien Bordetella pertussis (56) Viitejulkaisut - Anförda publikationer (57) Tiivistelmä - Sammandrag Keksinnön kohteena on uusia antigeenipreoaraatteja, jotka sisältävät proteiiniainesta, johon liittyy adenylaatti-syklaasi-aktiivisuus, B.pertussiksen viljelyistä, jolloin nämä preparaatit ovat käyttökelpoisia komponentteina ei-solu-hinkuyskärokotteissa. Keksintö antaa lisäksi menetelmiä tällaisten antigeenipreparaattien eristämiseksi. Uppfinningen avser nya antigenpreparat som innehåller proteinmaterial som förenats med adenylat cyklas-aktivitet i odlingar av B.pertussis, varvid dessa preparat är nyttiga som komponenter av acellulära kikhostvacciner. Uppfinningen ger ytterligare metoder för isolering av sådana antigenpreparat.
1 81262 Menetelmä adenylaatti-syklaasi-aktiivisuuteen liittyvän antigeenipreparaatin eristämiseksi Bordetella pertussisbakteerista 5 Keksinnön kohteena on menetelmä antigeenipreparaatin, joka sisältää proteiiniainesta, johon liitty adenylaatti-syklaasi-aktiivisuus (ACAP), eristämiseksi bakteerista Bordetella pertussis. Antigeenipreparaatteja käytetään soluttomissa rokotteissa Bordetella pertussisita 10 vastaan. Bordetella pertussis aiheuttaa ihmisillä vakavan ja uuvuttavan sairauden, jolle lapset ovat erityisen alttiita ja joka pidetään kurissa kehittyneissä maissa suurmittakaavaisilla immunisointiohjelmilla. On havaittu, että im- 15 munisointi on hyvin tärkeä tekijä vähennettäessä tätä sairautta ja että epäonnistuminen rokottamisessa voi johtaa tämän taudin lisääntyneeseen esiintymiseen. Käytännöllisesti katsoen kaikilla alueilla immunointi suoritetaan käyttäen kokosolu B.pertussis-rokotetta, jonka on havaittu 20 olevan suhteellisen tehokas taudin estämisessä. On kuitenkin todettu, että kokosolurokotteita rasittavat useat haitat. Siten esimerkiksi noin yhdellä jokaisesta 10 000 rokotetusta lapsesta esiintyy kliinisiä oireita, joita voivat olla kuume, paikalliset reaktiot ja jatkuva kirkumi- 25 nen. Lisäksi tapahtuu, että jotkut erät kokosolurokotteesta eivät anna ollenkaan suojaa, vaikka niihin silti liittyy ei-toivottujen sivuvaikutusten mandollisuus. Tämän taudin nykyisellä vähäisellä esiintymisellä kehittyneissä maissa, joilla on immunisointiohjelmat, hyö- 30 ty/vaara-suhde on huonosti määritelty ja monet lääkärit uskovat, että rokottamisen vaarat painavat enemmän kuin immunisoinnilla saavutetut edut. Tämän tuloksena monia lapsia ei rokoteta ja siten on olemassa vakava yleiskulkutaudin luontoinen hinkuyskävaara. Sentähden on huo- 35 mittavasti tutkimusponnisteluja suunnattu parannettujen
2 81262 hinkuyskärokotteiden kehittämiseksi ja erityisesti soluttomien rokotteiden kehittämiseksi, joista puuttuvat aineosat, jotka liittyvät tähän asti käytettyjen kokosolurokotteiden myrkyllisiin vaikutuksiin sisältäen samalla ne 5 aineosat, jotka ovat välttämättömät suojaamaan tautia vastaan. Turvallisemman, tehokkaan, soluttoman B.pertussis-rokotteen etsintää on aikaisemmin haitannut niukka informaatio, kokosolurokotteiden sisältämien B.pertussik- 10 sien tautia synnyttävien, myrkyllisten ja suojaavien osien vaikutuksen luonteesta ja mekanismista. Työ on sen tähden keskitetty 20 tai useamman B.pertussis-organismin pintaantigeenin eristämiseen ja puhdistamiseen ja niiden immuunireaktioita aikaansaavan kyvyn luonnehtimiseen (ks. 15 esimerkiksi J. Am. Med. Soc., 248 (1) 22-23). Esimerkkejä antigeeneistä, joita on ehdotettu tutkittaviksi, ovat imusolurunsautta edistävä faktori (pertussis-toksiini/lpf), rihmainen hemagglutiniini (FHA), lipopolysakkaridi (LPS), agglutinogeenit, dermonekroottinen toksiini (DNT), lämpöä 20 kestämättömät ja lämmönkestävät toksiinit, liuskatumainen valkosolu-estofaktori, adenylaattisyklaasi sekä muut pintakomponentit (Pertussis Vaccine Workshop. 11. helmikuu 1982, Bureau of Biologics, USA). Muita ehdotettuja ehdokasantigeenejä tutkimusta varten ovat henkitorvi-sytok- 25 siini ja erilaiset muut membraaniproteiinit. L.Pillemer kehitti erään varhaisen uutosrokotteen (Proc. Soc. Exp. Biol. Med. (1950) 75, 704-705), joka perustui rikottuihin B.pertussis-soluihin ja jonka havaittiin antavan suojaa, mutta sitä ei hyväksytty kaupallises- 30 ti preparaatin myrkyllisyyden takia. Esimerkkejä tuoreemmista B.pertussis-uutosrokotteista, joita on ehdotettu, ovat UK-patentissa 2 083 358A (Takeda) selostetut, joka patentti käsittää endotoksiinin poistamisen viljelyn päällä olevista nesteistä; ranska- 35 lainen patentti FR-2 047 886 (Institut Merrieux) käsittää
3 81262 mikrobisuspension uuttamisen anionisella pinta-aktiivisella aineella; ja japanilainen patentti JP-58-222032 (Teijin) käsittää alayksikkö-proteiinin, joka perustuu pertussis-toksiini (LPF):ään. 5 Suuri osa työstä, joka on suoritettu soluttomilla hinkuyskärokotteilla, on keskittynyt mandollisuuteen perustaa tällainen rokote LPF:ään. Uskotaan kuitenkin, että suurin osa (ellei kaikki) haitallisista vaikutuksista, joiden tähän asti on havaittu liittyvän hinkuyskärokotuk- 10 seen, liittyneet toksiiniin. Yhdistelmänä tetanus- tai difteriatoksoidin ja LPS:n kanssa se pystyy aiheuttamaan kokeellisen aivotaudin herkissä hiirissä (L. Steinman, et al. Nature (1982) 299, 738-740; Redhead et al, Workshop on B.pertussis, Nat. Inst. of Biol. Standards & Controls, 15 Holy Hill, Hampstead, Lontoo, 1983). Siten LPF voi mahdollisesti olla vastuussa aivovauriosta, jos tällaisia komplikaatioita ilmenisi rokottamisen jälkeen. Nyt on keksitty, että tietty proteiiniaines, joka liittyy adenylaattisyklaasi-aktiivisuuteen, kuten jäljem- 20 pänä selostetaan, ja jota löytyy B.pertussiksen viljelmistä, pystyy aikaansaamaan suojan B.pertussis-altistumista vastaan, kun sitä annetaan koe-eläimille. Tämä havainto, että proteiiniaines, joka tavallisesti liittyy adenylaatti-sykiaasi-aktiivisuuteen, on tärkein suoja-antigeeni 25 B.pertussista vastaan, sallii rokotevalmisteiden valmistamisen, jotka sisältävät antigeenipreparaatteja, jotka ovat vapaita, muista tunnetuista B.pertussis-komponenteista, jotka ovat vastuussa kokosolurokotteiden omaavista myrkyllisistä sivuvaikutuksista tai jotka sisältävät pie- 30 niä määriä niitä. Käsitettä "proteiiniaines, joka liittyy adenylaatti-syklaasi-aktiivisuuteen" (lyhennetty tämän jälkeen "ACAP":ksi) käytetään tässä tarkoittamaan proteiiniainesta, joka uuttuu yhdessä adenylaatti-syklaasi-aktiivisuuden 35 kanssa, kun adenylaatti-syklaasi-aktiivisuuden uuttaminen
4 81262 suoritetaan käyttäen glysiinin vesipitoista, hapanta (ph 3) liuosta (0,25 M). ACAP, kuten se edellä määritellään, voi olla itse adenylaatti-syklaasi-entsyymi tai entsyymiä sitoava proteiini. 5 Adenylaatti-syklaasi-aktiivisuus määritettiin E. Hewlett'in ja J.Wolff'in (J. Bacteriol. (1976) 127, 890-898) menetelmällä. Ensimmäiseksi tässä esitetään rokotevalmiste, joka suojaa B.pertussis'ta vastaan ja joka sisältää antigeeni-valmisteen, joka on peräisin ACAP':tä 10 sisältävästä B.pertussiksesta, joka on valinnaisesti toksoidoitu käyttäen esim. formaliinia, glutaraldehydiä tai B-propiolaktonia, yhdessä sen farmaseuttisesti hyväksyttävän kantimen kanssa. Yksityiskohtaisemmin ACAP voidaan havaita isoelekt- 15 risella fokusoinilla kahtena nauhana, joista toisen isoelektrinen piste (pi) on noin 7,0 ja toisen (haja)nauhan isoelektrinen piste on 7,2-7,4. Adenylaatti-syklaasi-aktiivisuus liittyy miltei kokonaan neutraaliin nauhaan (pi noin 7,0), mutta monoklonaaliset vasta-aineet ACAP:lle 20 sitoutuivat voimakkaasti kumpaankin nauhaan. Edellä mainituissa valmisteissa olevan ACAP:n suhteellinen molekyylipaino on yleensä noin 67000-73000, erityisesti 69000, ja isoelektrinen piste 7,0-7,4 jäljempänä selostettavissa valmistusolosuhteissa. 25 "Suhteellisella molekyylipainolla" tarkoitetaan näennäistä molekyylipainoa määritettynä 12-%:isella (paino/paino) polyakryyliamidigeelielektroforeesilla ja standardimolekyylipainon merkkiaineilla. Kuvattujen antigeeniproteiinien molekyylipaino voidaan siten mukavasti mää- 30 rittää menetelmällä, jonka on selostanut U.K. Laemmli, Nature, 1970, 227, 680-685. Sopivia standardi molekyylipainon merkkiaineita ovat esimerkiksi naudan seerumialbumiini, kymotrypsinogeeni A ja ribonukleaasi. Myös aminohappoanalyysi on osoittanut, että ACAP 35 sisältää epätavallisen suuren osuuden proliinia, niin että
5 81262 proliini/glutamiinihappo-suhde on noin 1:1 ja tämä ominaispiirre tekee mandolliseksi ACAP:n erottamisen muista B.pertussis-proteiineista. Eräs toinen ACAP:n erottava ominaispiirre on, että sitä ei voida havaita tyrosiini- 5 tähteiden radiojodauksella, ei klooriamiini T- eikä jodogeenimenetelmin. Erään edullisen suoritusmuodon mukaisesti edellä mainittu ACAP on proteiiniaines, jota luonnehditaan sillä, että sillä on yksi tai useampi seuraavista ominaisuuk- 10 sista: (i) proliini/glutamiinihappo-suhde pääasiallisesti 1:1; (ii) tyrosiini-tähteet eivät ole jodattavia; (iii) pääasiallisesti vapaa solunsisäisestä B.pertussisaineksesta; 15 (iv) suhteellinen molekyylipaino 67000-73000; (v) isoelektrinen piste 7,0-7,4 ja (vi) se on happoa kestämätön ph:ssa alle noin 3. Edellä mainitut rokotevalmisteissa käytettävät antigeenipreparaatit voivat, jos niin halutaan, sisältää 20 pieniä määriä muita antigeeni-yhdisteitä ACAP:n lisäksi, esimerkiksi aineksia, jotka saadaan yhdessä B.pertussisorganismista uutetun ACAP:n kanssa. Tällaiset ainekset voivat olla LPS- ja LPF-osasia, jotka ottaen huomioon niiden mandolliset vahingolliset sivuvaikutukset, vaativat 25 toksoidoimista, esim. formaliinilla. Antigeenivalmisteet ovat kuitenkin, edullisesti, pääasiallisesti vapaat muista antigeenikomponenteista. Adenylaatti-syklaasia on aikaisemmin eristetty B. pertussiksesta (E. L. Hewlett et al., J. Bacteriol., 127, 30 890-898 ja Proc. Nat. Acad. Sci., USA, 73, 1926-1930), mutta ei ole missään ehdotettu että tämä aines on B.pertussis'ta vastaan suojaava antigeeni. Hewlett'in et al., työn mukaisesti havaittiin ainoastaan noin 20 % B.pertussis-organismin adenylaatti-syklaasi kokonaisaktiivi- 35 suudesta, mikä edustaa noin 0,5 % kokonaisentsyymistä,
6 81262 viljelmän päällä olevasta nesteestä, jolloin loput 80 % on sitoutuneena soluihin. Sentähden tarvitaan uuttoprosessi, jolla ACAP voidaan saada hyvin puhtaana ja suurella saannolla, jotta saadaan riittäviä määriä, kaupallisessa mit- 5 takaavassa, ACAP:iä käytettäväksi edellä valmistetuissa antigeenipreparaateissa. Eräs päävaikeus, joka on voitettava tällaisessa uuttoprosessissa on, että ACAP, muiden proteiinien joukossa on osittain sitoutunut hyvin lujasti, ulkomembraanin LPS-runkoon. Aikaisemmin on yleisesti käy- 10 tetty detergenttejä membraanin liuentamiseksi siihen liittyneiden proteiinien vapauttamiseksi. Detergenttien käytöllä ulkomembraanin proteiinien uuttamiseen B.pertussisorganismeista on kuitenkin havaittu olevan seuraavat haitat: 15 a) ulkomembraani liukenee, jolloin muodostuu misellikasaumia, jotka sisältävät ulkomembraanin proteiinien seoksia; b) ulkomembraanin proteiinit voivat vahingoittua; c) saattaa syntyä uusia antigeenejä, joita ei esiinny bak- 20 teerissa; ja d) yleensä todetaan että uutettu aines on veteen :Liukenematonta detergentin poistamisen jälkeen. Nyt on keksitty, että vastakohtana detergenttien käytölle, B.pertussis-organismien ulkomembraanin uutta- 25 minen käyttäen säädeltyjä, lievästi happamia olosuhteita johtaa olennaisesti lisääntyneisiin adenylaatti-syklaasin saantoihin (noin 40 kertaa parempi kuin tähän asti esitetyillä menetelmillä) muodossa, joka on vesiliukoinen. Siten tämä keksintö kohdistuu menetelmään antigee- 30 nipreparaatin, joka sisältää ACAP B.pertussiksesta, eristämiseksi. Menetelmälle on tunnusomaista, että Bordetella pertussis -solujen viljelmää käsitellään vesipitoisella aminohappopuskurilla, jonka ph on 2,5-3,5 ja joka sisältää tätä aminohappoa hypertoonisena pitoisuutena solu- 35 jen suhteen, solut erotetaan syntyneestä supernatantista
7 81262 ja eristetään ACAP'tä sisältävä antigeenipreparaatti supernatantista. Edellä selostetussa menetelmässä käytetty puskuri antaa edullisesti ph:n noin 3 ja se sisältää edullisesti 5 epäorgaanista happoa, edullisesti kloorivetyhappoa, puskurin happamana komponenttina ja joko glysiiniä tai alaniinia aminohappona. Solujen käsitteleminen puskurilla suoriteyaan edullisesti lämpötilassa 5-50 C, erityisesti 30-45 C:ssa ja ihanteellisesti 37 C:ssa, edullisesti 1-24 10 tunnin ajan, erityisesti 10-20 tunnin ajan aminohappoväkevyydellä 0,1-1M, edullisesti 0,25 M. ACAP on happoa kestämätön ja voi tuhoutua, jos ph laskee alle 3:n uuton aikana. Sen jälkeen kun solut on inkuboitu puskurin kanssa 15 solut hävitetään ja sentrifugoinnin jälkeen, esim. noin 100000 g:ssä (kaiken osasmaisen aineksen poistamiseksi) saatu päällä oleva neste saostetaan haluttaessa, esim. käyttäen ammoniumsulfaattia, kylmää etanolia tai asetonia. Päällä olevasta nesteestä saatu uute on testattu 20 Kendrick-testissä, kuten seuraavassa selostetaan, ja sen on havaittu antavan suojan hiirillä aivojen sisäistä B. pertussis-altistumista vastaan. Vertailurokotteiden, jotka eivät sisältäneet adenylaatti-syklaasi-aktiivisuutta, havaittiin antavan vähän tai ei ollenkaan suojaa B.pertus- 25 sis-altistumista vastaan, mikä tuo mieleen, että ACAP voi itse asiassa olla tärkein tekijä immnisuudessa. Ei-suojaavien kokosolurokotteiden panosten analyysi on myös osoittanut, että suojaamattomuudella on taipumus liittyä adenylaatti-syklaasi-aktiivisuuden puutteeseen, mikä edelleen 30 johdattaa mieleen, että ACAP voi olla avain-antigeeni, joka on tarpeen immuunivasteen synnyttämiseksi B.pertussista vastaan. Kendrick-testissä käytetty päällä olevasta nesteestä saatu uute voi kuitenkin sisältää myös ACAP:n pienissä 35 määrissä kompleksoituneena muiden proteiinien kanssa, jot-
8 81262 ka sisältävät LPS-osasia, jossa tapauksessa on toivottavaa puhdistaa ainesta edelleen, kun sitä käytetään rokotevalmisteissa. Siten edelleenpuhdistaminen voidaan suorittaa esimerkiksi ioninvaihtokromatografialla ja/tai pre- 5 paratiivisella isoelektrofokusoinnilla kompleksoituneen aineksen poistamiseksi. Vaihtoehtoisesti kaksi puhdistusmenetelmää voidaan yhdistää, ts aines, joka ei ole pidättynyt DEAE-geeliin (ts kompleksoitumaton aines) voidaan elektrofokusoida. Puhdistusmenetelmä voi käsittää myös 10 kromatofokusoinnin. Edellä selostettujen puhdistusvaiheiden jälkeen ACAP':tä voidaan haluttaessa puhdistaa edelleen, esimerkiksi viemällä aines immunosorbentti-pylvään läpi, joka sisältää sopivaa monokionaalista vastaainetta ACAP:tä vastaan. 15 Edellä selostettuja antigeenipreparaatteja, edellä selostetulla keksinnön mukaisella menetelmällä valmistetut mukaanlukien, voidaan yhdistää rokotevalmisteisiin immunisoinnin aikaansaamiseksi hinkuyskää vastaan ihmisellä. Tätä tarkoitusta varten antigeeniproteiinia voidaan antaa 20 yhdessä farmaseuttisesti hyväksyttävän kantimen tai apuaineen kanssa. Farmaseuttisesti hyväksyttäviä kantimia ovat tässä tapauksessa nestemäiset väliaineet, jotka sopivat käytettäviksi välitysaineina antigeenin viemiseksi potilaaseen. 25 Eräs esimerkki tällaisesta kantimesta on suolaliuos. Antigeeniproteiini voi olla liuoksessa tai suspendoituna kiinteänä aineena kantimeen. Rokotepreparaatti voi sisältää myös apuaineen immuunivasteen stimuloimiseksi jolloin rokotteen vaikutus 30 lisääntyy. Sopivia käytettäviä apuaineita ovat esimerkiksi alumiinihydroksidi ja alumiinifosfaatti. Sopivasti rokotevalmisteet tehdään sisältämään antigeeniproteiinia loppuväkevyydessä alueelta 0,01 5 mg/ml, edullisesti 0,03-2 mg/ml ja edullisimmin 0,3 mg/ml. Val- 35 miiksimuodostamisen jälkeen rokote voidaan sisällyttää
9 81262 steriiliin säiliöön, joka sitten suljetaan ja varastoidaan matalassa lämpötilassa, esimerkiksi 4 C:ssa, tai se voidaan kylmäkuivata. Immuuniteetin aikaansaamiseksi hinkuyskälle ih- 5 misellä annetaan sopivasti muodostettua rokotetta yhtenä tai useampana annoksena. Suositellaan, että jokainen annos on 0,1-2 ml, edullisesti 0,2-1 ml, edullisimmin 0,5 ml rokotetta. Tässä kuvataan edelleen menetelmä immuniteetin aikaansaamiseksi hinkuyskälle ihmisellä, minkä mukaan te- 10 hokas määrä edellä määriteltyä rokotevalmistetta annetaan isännälle. Keksinnön mukaisesti valmistettu ACAP:n voidaan siis käyttää rokotteen valmistamiseksi, jota käytetään immuniteetin aikaansaamiseksi hinkuyskälle ihmisellä. 15 Näitä rokotteita voidaan antaa jollakin tavanomaisella menetelmällä rokotteiden antamista varten, kuten suun kautta ja ruoansulatuskanavan ulkopuolisesti (esim. ihonalaisesti tai lihaksensisäisesti) ruiskeena. Käsittely voi käsittää yhden ainoan annoksen rokotetta tai jou- 20 kon annoksia jonakin ajanjaksona. Tässä esitetyt rokotteet voivat sisältää myös yhden tai useampia muita antigeenikomponentteja, kuten esimerkiksi sopivasti toksoidoituja tyfoidi- ja difteriatoksiineja tai muita B.pertussis-antigeenejä, kuten tok- 25 soidoitua LPF, vähentämään B.pertussiksen mutanttikantojen todennäköisyyttä välttää samanaikainen immuunivaste. Seuraavat esimerkit valaisevat keksintöä: Esimerkki 1 Hapan glysiini-hydrolyysi ja ulkomembraanin raaka- 30 proteiinien valmistus Solut kerättiin talteen 3/4-osassa eksponentiaalivaihetta ja sentrifugoitiin 8000 g:ssä (Sorvall, GSA-kartiopää) 20 min 4 C:ssa. Solujen päällä oleva neste erotettiin lappoa käyttäen ja solut suspendoitiin välittömästi 35 uudelleen varoen tislattuun veteen tiheyteen 20-30 mg/ml
10 81262 solujen kuivapainoa. Lisättiin kolmannes tästä tilavuudesta 1M glysiini-hc1-puskuria, ph 3,0, lievästi sekoittaen glysiinin loppuväkevyyden 250 mm saamiseksi. Glysiiniliuos sisälsi EDTA (antamaan 5 mm lopulliseen seokseen) 5 entsyymiaktiivisuuden pysähdyttämiseksi. ph tarkistettiin ja kun oli tarpeen, asetettiin uudelleen ph 3,0:aan käyttäen 1-2 M HC1. Seosta sekoitettiin varoen 37 C:sella vesihauteella kunnes lämpötila tasapainottui ja inkuboitiin sitten yli yön (18 tuntia) 37 C:ssa (ilman sekoittamista). 10 ph asetettiin sitten 7,2-7,4:ään käyttäen 10 M NaOH, joka lisättiin hitaasti paikallisten ylimäärien välttämiseksi. Soluja sedimentoitiin 5000 g:ssä 20 min 5 C:ssa, niiden päällä oleva neste erotettiin lapolla, jäähdytettiin jäävesihauteella 1-2 C:seen ja lisättiin hitaasti 2 tilavuut- 15 ta esijäähdytettyä asetonia (-20 - -40 C) välttäen lämpötilan nousua yli 1-2 C:n. Seosta pidettiin -20 C:ssa 3-5 tuntia ja sakka koottiin esijäähdytetyssä (-10 C) kartiopäässä 4000 g:ssä 20 minuutin aikana. Päällä oleva neste lapottiin eroon ja hävitettiin. Sedimentoitu sakka 20 liuotettiin jäillä jäähdytettyyn tislattuun veteen noin 1/20-osaan solususpension alkuperäisestä tilavuudesta. Liuos vapautettiin sitten liukenemattomista aineksista ja rakkuloista sentrifugoimalla 50 000 g:ssä 90-120 min 5 C:ssa. Päällä oleva neste kerättiin ja pidettiin jäähdy- 25 tettynä tai kylmäkuivattiin. Ennen kylmäkuivausta lisättiin 1 $, paino/tilav., mannitolia. Saatiin 40-80 mg proteiinia grammaa kohti solujen kuivapainoa. Esimerkki 2 (a) Ulkomembraanin raakaproteiini-valmisteiden erot- 30 taminen DEAE-trisakryyli-kromatografialla. DEAE-trisakryyli-pylväs, 3 x 16 cm, tasapainotettiin 0,025 M Tris'illä, 0,035 M NaCl-puskurilla, ph 8,8, ja esimerkissä 1 saatu aines (korkeintaan 1 g proteiinia) dialysoitiin tasapainottavaa puskuria vastaan ja pumpat- 35 tiin nopeudella 60 ml/h pylvään läpi. Jakeet 1-13 (99 pi-
11 81262 saraa/putki, noin 5 ml) yhdistettiin yhteispanokseksi. Osa käytetystä kokonaisproteiinista (noin 1/4) ei pidäty gee- likerrokseen ja kerääntyy laajaksi huipuksi (kuv. 1, 0,035 M). Pidättynyt aines eluoitiin sitten käyttäen 0,1, 5 0,2, 0,3 ja 1,0 M NaC1 0,025 M trispuskurissa (ph 8,8). Jakeet yhdistettiin ja levitettiin SDS-PAGE-levylle proteiinien erottumisen toteamiseksi. ACAP oli läsnä aineksessa, jota pylväs ei pidättänyt, kuten SDS-PAGE osoittaa, mutta sitä oli läsnä myös pidättyneessä aineksessa, joka 10 eluoitui 0,2 M NaC1:lla. (b) Preparatiivinen vaakakerros-isoelektrofokusointi rakeistetussa geelissä (IEF) Tämä suoritettiin LKB-suositusten mukaisesti (Application Note 198, LKB-Producter AB, Bromma, Ruotsi). 15 Suspensio, jossa oli 4 g Ultrodex (LKB) ja 5 ml esisekoitettua Ampholinea, ph 3,5-9,5, suspendoitiin tislattuun veteen 100 ml:n lopputilavuuteen, kaadettiin vaakasuoraan kaukaloon 10,8 x 24,3 cm ja haihdutettiin ilmavirran avulla suositeltuun rajaan. Kerrostettuja kolmen paperitukon 20 (LKB, 2117-106) liuskoja, joita oli liotettu saman Ampholinen 1:20-laimennuksessa tislatussa vedessä, pantiin kaukalon kumpaankin päähän. Aines esimerkistä 2a upotettiin geeliin käyttäen levitysmatriisia (2 x 9,4 cm), joka puristettiin geeliin pituussuunnassaan 1/3-1/4-osan etäi- 25 syydelle anodipäästä, sisäänsuljettu geeli poistettiin, siirrettiin 10 ml:n kertakäyttöruiskuun, suspendoitiin 3 ml:aan ainesta esimerkistä 2a (joka sisälsi korkeintaan 500 mg proteiinia) ja ruiskutettiin lopuksi takaisin tyhjään tilaan, joka syntyi sen poistamisesta. Geeliä tasoi- 30 tettiin sitten lastalla tarpeen mukaan ja annettiin tasa- painottua 20 minuuttia. Sillä välin yksi paperitukko imeytettiin fosforihapon (ominaispaino 1,75) 1:100-laimennuksella ja lisättiin liuskoihin anodi-päässä ja toinen imeytettiin 1 M NaOH:ssa ja pantiin katodi-päähän. Kauka- 35 loalustaa vaakakerros IEF-laitteessa (Pharmacia tyyppi FBE-3000) jäähdytettiin juoksuttamalla vesijohtovettä (15 C) käytön aikana. Geeliä käytettiin muuttumattomalla 8 watin teholla.
12 81262 ACAP oli havaittavissa kahtena nauhana, toinen pi 7,0 ja toinen (haja) nauha pi 7,2-7,4:ssä. Adenylaattisyklaasi-aktiivisuus yhdistyi miltei kokonaan keskusnauhaan (pi 7,0), mutta monoklonaaliset vasta-aineet 5 ACAP:lle sitoutuivat voimakkaasti kumpaankin nauhaan. Metallimatriisia käyttäen geelikerros jaettiin sitten 30:een rinnakkaiseen kenttään, geeli raaputettiin jokaisesta kentästä käyttäen lastaa ja siirrettiin koeputkiin, jotka sisälsivät 1 ml tislattua vettä. Jokaisen ja- 10 keen ph mitattiin tässä vaiheessa. Geelisuspensiot siirrettiin sitten pieniin muovipylväisiin, eluoitiin 2 m1:11a 0,2 M ammoniumbikarbonaatti-puskuria, ph 7,0 ja geeli-vapaat eluaatit jäädytettiin (-40 C). (c) Analyyttinen isoelektrinen fokusointi 15 (i) Käytettiin samaa menettelytapaa kuin edellä 2(b):11e, mutta käytettiin 12-%:sta polyakryyliamidigeeliä 8 M urean läsnäollessa. Saatiin samat tulokset kuin 2(b):11e. (ii) Sama menetelmä, mutta käyttäen agaroosigeeliä 10 %:n 20 sorbitolia läsnäollessa antoi 4 immunoreaktiivista nauhaa pi 4,5-6,0. pi 4,0:n nauha pidätti adenylaatti-syklaasiaktiivisuuden pääosan. Esimerkki 3 ACAP:n puhdistaminen käyttäen monoklonaalista immu- 25 nosorbentti-pylvästä Hiiren vesivatsanestettä, joka sisälsi monoklonaalista immunoglobuliinia, joka on spesifinen ACAP:lle, saostettiin huoneen lämpötilassa lisäämällä 2 tilavuutta 27-%:sta, paino/tilav., Na 2SO 4 ja annettiin seistä 2-4 tun- 30 tia ennen sedimentoimista (2000 g, 15 min). Sedimentti liuotettiin uudelleen ja dialysoitiin PBS vastaan. 500 mg tätä proteiinia (UV-määritys) kytkettiin 70 ml:aart sullottua CNBr-Sepharose CL4B'tä valmistajan (Pharmacia) ohjeita seuraten. Sephadex G-50 (väliainetta) pantiin 35 500 mm x 25 mm:n pylvääseen kerroskorkeuteen 220 mm. Pyl-
13 81262 vään pesemisen jälkeen eluoimispuskurilla (0,2 M ammoniumbikarbonaatti, ph 7,0, joka sisälsi 0,01 % Thiomersal) kaadettiin Sephadex -kerroksen päälle 5 mm:n paksuinen kerros nro 12 Ballotini-lasihelmiä. Lisäpesun jälkeen im- 5 munosorbenttigeeliä kaadettiin Ballotini-lasihelmikerrokselle, jolloin tämä erottui Sephadexista sallien kummankin erottamisen. Pylvästä pestiin edelleen eluoimispuskurilla ja lopuksi pantiin 100 mm korkean immunosorbenttikerroksen päälle toinen Ballotini-lasihelmikerros suojaa- 10 maan pylvään yläpäätä. ACAP:n erottamiseksi immunosorbentti-pylväällä lisättiin 180 ml pidättymätöntä eluaattia DEAE-tris-akryyli-erotuksesta (esimerkki 2), joka sisälsi 1 mg/ml proteiinia (Lowry), 5 C:ssa immunosorbenttipylvääseen 15 nopeudella 0,25 ml/min, pestiin eluoimispuskurilla (0,2 M ammoniumbikarbonaatti, ph 7, 0,01 %, paino/tilav., Thiomersal) ja, senjälkeen kun perusviiva oli stabiloitunut, pylvääseen pantiin 50 ml 6 M ureaa eluoimispuskurissa absorboituneen aineksen eluoimiseksi.immunosorbentti-ainek- 20 sen sijoittaminen Sephadex ID G-50-kerroksen päälle salli proteiinin samanaikaisen erottamisen ureasta käytön aikana. Esimerkki 4 B.pertussiksen viljely 25 Määritelty elatusaine, jota käytettiin organismin viljelyyn, perustui Steiner'in ja Scholte'n (1971) kaavaan, kuten aikaisemmin on selostettu (Novotny ja Brookes, 1975). Kaikkia viljelyjä viljeltiin 36-37 C:ssa. Nesteviljelyt irtonaisesti tulpilla suljetuissa ravistuspulloissa 30 (500 ml:n kartiomainen pullo, jossa on 200 ml elatusainetta) siirrostettiin viljelyllä, jota oli viljelty 48 tuntia Cohen-Wheeler-ravintoalustalla, jossa oli 2 % agaria ja 5 % hevosen verta, ja sekoitettiin antamaan kaasunvaihtonopeus 20-40 pm 0 2 /h. Tällaisia nesteviljelyjä käytettiin 35 elatusaineen siirrostamiseen 5 1:n tai 70 1:n kokonaan
14 81262 lasista tehdyissä fermentoreissa, samalla pitäen ph 7,6:ssa lisäämällä säädetysti 2 M HC1 ja pitäen liuenneen hapen kyllästys 5-10 %:ssa potkurisekoituksella. Viljelyt korjattiin talteen eksponentiaalivaiheen päätyttyä, ts. 5 noin 36 tunnin inkuboinnin jälkeen (Novotny ja Cownley, 1978). Esimerkki 5 Kendrick-koe T Tämä suoritettiin WHO-vaatimusten mukaisesti Per- 10 tussis-rokotetta varten käyttäen MFI tai NIH hiiriä (OLAC, kategoria 3, vapaat useimmista taudin synnyttäjistä B. bronchiseptica mukaanlukien), jotka painoivat 14-16 g. Antigeeni, 0,5 ml:n tilavuuksissa, annettiin vatsaontelon sisäisesti ja käsittivät huippulaimennuksen ja kolme 4-15 kertaista sarjalaimennusta. Kanden viikon kuluttua hiiriä provosoitiin aivojen sisäisesti käyttäen suositeltua provosointikantaa 18-323 (100-200 LD50 ). Eloonjääneiden lukumäärää kussakin ryhmässä käytettiin ED 50 :n ja suhteellisen tehokkuuden laskemiseen suhteessa British Pertussis Refe- 20 rence Vaccine 66/84:ään käyttäen yhdensuuntaisviivatodennäköisyysanalyysiohjelmaa. Suoritettiin myös vertailukoe käyttäen FHA/LPF-rokotetta. Tulokset on esitetty taulukossa 1. 25 30 35
15 81262 Taulukko 1 Bordetella pertussis-jakeiden suojausteho hiirien suojaustestissä B.pertussis 18-323:n aivojen sisäistä provokaatiota vastaan ("Kendrick-testi") 5 Aines ED50 Suhteel- 41.0 pg:ssa prote- Pg Linen te- iinia (=yksinkerhokkuus tainen ihmisen an- I.U./pg annos) proteii- 10 nia 15 20 25 30 B.pertussiksen raaka glysiinihydrolysaatti, hydrolysoitu 37 C:ssa B.pertussiksen raaka glysiinihydrolysaatti, hydrolysoitu 4 C:ssa 20 0,02 190 77 0,003 1333 - hydrolysoitu 20 0,011 363 37 C:ssa - hydrolysoitu 149 0,001 4000 53 C:ssa B.pertussis-immunopuhdistettu adenylaatti-syklaasi 19 0,011 364 FHA/LPF-rokote 77 0,003 1333 Esimerkki 6 ACAP:n aminohappoanalyysi Aminohappoanalyysi suoritettiin käyttäen Rank Hilger Chromaspek-aminohappoanalysaattoria. Näytteet valmis- 35 tettiin lisäämällä 250 pl 6N HC1 (laimennettu BDH Aristar-laadusta), joka sisälsi 0,1 % (paino/tilav.) fenolia, kuivattuun näyteainekseen paksuseinäisessä Pyrexkoeputkessa (7,5 x 1,2 cm). Putkia vedettiin sitten happi/luonnonkaasu poltinliekillä kapean aukon aikaansaami- 40 seksi. Sisällön pakastamisen jälkeen kiinteässä CO 2 - etanolihauteessa, jokainen putki yhdistettiin jakoputkis-
16 81262 ton ja loukun kautta suurtyhjöpumppuun ja annettiin olla 10 minuuttia ilman poistamiseksi. Putket sulatettiin sitten umpeen ja pantiin 110 C:seen uuniin hydrolyysiä varten. Hydrolysoidut näytteet kuivattiin tyhjöeksikaatto- 5 rissa natriumhydroksidipelleteillä. Kuivattu jäännös liuotettiin 250 pl:aan aminohappoanalysaattorin lähtöpuskuria automaattista analyysiä varten. Taulukossa 2 esitetyt aminohappoarvot ovat keskiarvoja tuloksista, jotka saatiin rinnakkaisista 24:n, 10 48:n ja 68:n tunnin hydrolyyseistä paitsi valiinin ja isoleusiinin tapauksessa, jolloin käytettiin 68 tunnin hydrolyysiarvoja. Kystiinin, kysteiinin ja tryptofaanin arvoja ei voitu määrittää tällä menetelmällä. 15 Taulukko 2 20 25 30 Tähteet Asparagiinihappo(+ asparagiini) 48 Treoniini 33 Seriini 33 Glutamiinihappo(+ glutamiini) 62 Proliini 60 Glysiini 77 Alaniini 82 Valiini 54 Metioniini 4 Isoleusiini 22 Leusiini 50 Tyrosiini 7 Fenyylialaniini 11 Histidiini 13 Lysiini 19 Arginiini 37 35
17 81262 Esimerkki 7 Rokotevalmisteita Immunisoinnissa käytettäviä rokotteita valmistetaan tavallisin menetelmin seuraavin aineosin: 5 a) Difteria-, Tetanus- ja Pertussis-rokote yksinkertai- sessa liuoksessa. Jokainen 1 ml rokotetta sisältää: Difteria-toksoidia Tetanus-toksoidia >60 I.U. >120 I.U. Keksinnön mukaisesti valmistettua 10 Pertussis-antigeeniä >0,363 mg Natriumboraattia Meripihkahappoa Thiomersal Natriumkloridia <10,03 mg <3,10 mg 0,04-0,2 mg <8,5 mg 15 Vettä 1 ml:ksi b) Adsorboitu Difteria-, Tetanus- ja Pertussis-rokote Difteria-, Tetanus- ja Pertussis-komponentit adsorboidaan alumiinihydroksidigeelille standardimenetelmin. Jokainen 20 1 ml rokotetta sisältää: Difteria-toksoidia Tetanus-toksoidia Keksinnön mukaisesti valmistettua antigeeniä >60 I.U. >120 U.L. >0,363 mg 25 Liukenemattomia alumiini-suoloja < samanarvoinen 0,093 moolille (2,5 mg) Al. Natriumboraattia Meripihkahappoa <8,01 mg <2,48 mg 30 Thiomersal 0,04-0,2 mg Natriumkloridia Vettä c) Pertusiss-rokote Jokainen 1 ml rokotetta sisältää: <6,8 mg 1 ml:ksi 35 Keksinnön mukaisesti valmistettua >0,363 mg antigeeniä Thiomersal Natriumkloridia Vettä 0,04-0,2 mg <8,5 mg 1 ml:ksi
18 81262 Patenttivaatimukset 1. Menetelmä antigeenipreparaatin, joka sisältää proteiiniainesta, johon liitty adenylaatti-syklaasi-ak- 5 tiivisuus (ACAP), eristämiseksi bakteerista Bordetella pertussis, tunnettu siitä, että Bordetella pertussis -solujen viljelmää käsitellään vesipitoisella aminohappopuskurilla, jonka ph on 2,5-3,5 ja joka sisältää tätä aminohappoa hypertoonisena pitoisuutena solujen suh- 10 teen, solut erotetaan syntyneestä supernatantista ja eristetään ACAP'tä sisältävä antigeenipreparaatti supernatantista. 2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, t unnettu siitä, että ph on pääasiallisesti 3. 15 3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, t unnettu siitä, että käsittely puskurilla kestää 10-20 tuntia. 4. Jonkin patenttivaatimuksista 1-3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että käsittely pus- 20 kurilla suoritetaan lämpötilassa 30-45 C. 5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, t unnettu siitä, että lämpötila on pääasiallisesti 37 C. 6. Jonkin patenttivaatimuksista 1-5 mukainen me- 25 netelmä, tunnettu siitä, että aminohappo on glysiini tai alaniini. 7. Jonkin patenttivaatimuksista 1-6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että eristäminen supernatantista käsittää ioninvaihtokromatografiaa. 30 8. Jonkin patenttivaatimuksista 1-7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että eristäminen supernatantista käsittää isoelektrista fokusointia. 9. Patenttivaatimuksen 7 tai 8 mukainen menetelmä, t unnettu siitä, että eristäminen käsittää edel- 35 leen eristetyn aineksen viemisen immunosorbenttipylvään läpi, joka sisältää sopivaa monoklonaalista vasta-ainetta ACAP'tä vastaan.
19 81262 Patentkrav 1. Förfarande för isolering av ett antigenpreparat, som innehåller proteinmaterial associerat med adeny- 5 lat-cyklas-aktivitet (ACAP) ur bakterien Bordetella pertussis, k ä n n e t e c k n a t dörav, att man behandlar en odling av Bordetella pertussis -celler med en vattenhaltig aminosyrabuffert, vars ph är 2,5-3,5 och som innehåller sagda aminosyra i en hypertonisk koncentration i 10 förhållande till cellerna, cellerna separeras ur den resulterande supernatanten och antigenpreparatet som innehåller ACAP isoleras ur supernatanten. 2. Förfarande enligt patentkravet 1, kännetecknatdärav, att ph huvudsakligen är 3. 15 3. Förfarande enligt patentkravet 1 eller 2, k ä n n e t e c k n a t därav, att behandlingen med buffert räcker 10-20 timmar. 4. Förfarande enligt något av patentkraven 1-3, k ä n n e t e c k n a t därav, att behandlingen med buf- 20 fert urförs vid en temperatur på 30-45 C. 5. Förfarande enligt patentkravet 4, kännetecknatdärav, att temperaturen huvudsakligen är 37 C. 6. Förfarande enligt något av patentkraven 1-5, 25 k ä n n e t e c k n a t därav, att aminosyran är glycin eller alanin. 7. Förfarande enligt något av patentkraven 1-6, k ä n n e t e c k n a t därav, att isoleringen ur supernatanten omfattar jonbytarkromatografi. 30 8. Förfarande enligt något av patentkraven 1-7, k ä n n e t e c k n a t därav, att isoleringen ur supernatanten omfattar isoelektrisk fokusering. 9. Förfarande enligt patentkravet 7 eller 8, k ä n n e t e c k n a t därav, att isoleringen ytter- 35 ligare omfattar passage av det isolerade materialet genom en immunosorbentkolonn, som innehåller en lämplig monoklonal antikropp mot ACAP.