Eläinkokeettomien menetelmien validoinnin nykytilanne

Transkriptio

1 Finnish Consensus Platform for Alternatives to Animal Experimentation Eläinkokeettomien menetelmien validoinnin nykytilanne Tuula Heinonen FICAM Tampereen yliopisto FinCopa seminaari

2 Mitä validointi tarkoittaa? Validointi on prosessi, jonka avulla osoitetaan testin, lähestymistavan, prosessin tai arvioinnin relevanttisuus (oikeellisuus, relevance) ja luotettavuus (reliability) tiettyä käyttötarkoitusta varten. OECD TG 34 ohjeistaa validointia: OECD SERIES ON TESTING AND ASSESSMENT, Number 34. GUIDANCE DOCUMENT ON THE VALIDATION AND INTERNATIONAL ACCEPTANCE OF NEW OR UPDATED TEST METHODS FOR HAZARD ASSESSMENT

3 Mitkä testit on validoitava Periaatteessa olisi hyvä kaikki EU-lainsäädännön/OECD-ohjeistojen testit tulee validoita Turvallisuustestit: In vitro-testit, in silico, eläintestit

4 Miten saadaan testi viranomaisohjeistoihin Tarjotaan EU-komission keskukselle EURL- ECVAMlle Tarjotaan suoraan OECDlle Prosessit ja kaavakkeet löytyvät asianomaisilta sivuilta

5 Finnish Consensus Platform for Alternatives to Animal Experimentation EURL-ECVAM validation process Interaction with validation bodies of other countries/areas in the framework of the International Collaboration FinCopa-seminaari on T. Heinonen Alternative Methods (ICATM).

6 OECD-tason in vitro-testit Endpoint Test OECD Test guideline Skin irritation Skin corrosion Eye corrosion and severe irritants Genotoxicity Several human reconstructed skin models and other models Several human reconstructed skin and other models Isolated eye, MDCK CB977 tubular epithelial cells Several tests to detect mutagenicity and clastogenicity TG439 TG 430, 431, 435 TG437, 438, 460 TG487, 471, 473, 476, 479, 480, 481, , 487 Endocrine discrupters Estrogen Receptor Agonists TG455, 457 Steroidogenesis (production of 17ß-estradiol and testosterone) H295R Steroidogenesis Assay TG456 Skin absorption Excised skin TG428 (ECVAM validated) Photocytotoxicity and cytotoxicity (+/- visible light) Skin Sensitisation (Protein binding, ARE-Nrf2 Luciferase Test Method=keratinocytes) In Vitro 3T3 NRU Phototoxicity In Chemico Skin Sensitisation In vitro cell test FinCopa-seminaari T. Heinonen TG432 TG442C (Direct Peptide Reactivity Assay DPRA), 442D (ARE-Nrf2 Luciferase Test Method)

7 Skin absorption/penetration: Reconstructed Human Epidermis Test Method Testiaineen applikointi konstruktin päälle 2. Inkubointi 37 C, 5% CO2 24 tuntia 3. Absorptiomääritykset mediumnäytteille otettuna 1, 2, 3, 6 ja 24 tuntien kuluttua altistuksesta 4. Otettava medium korvataan aina uudella. Testiaineen määrä määritetään mediumista. 5. Altistuksen lopussa tehdään histopatologinen analyysi kudoksesta sekä määritetään solujen elinkykyisyys MTT (mittaa mitokondriaalista aktiivisuutta).

8 Finnish Consensus Platform for Alternatives to Animal Experimentation ADME, Toksikokinetiikka 1. Validoinnissa: Toxikokinetiikka, CYPien induktio: cryopreserved human hepatocytes and cryopreserved human metabolically competent cell line (HepaRG ) 2. Kehityksen alla: 1. Barrierimallit: Lung, MucilAir, BBB 2. Metabolia: HepaRG cells as three dimensional metabolic competent structures in a spinnerbioreactor. CYPs

9 Finnish Consensus Platform for Alternatives to Animal Experimentation Paikallistoksisuus Silmän syövytys ja vakava ärsytys Valotoksisuus Ihon syövyttävyys Ihoärsytys Ihon herkistys

10 Silmän syövyttävyys ja ärsytys Testisysteemi: Eristetty kanan tai naudan silmä (teurastamosta) Päätepisteet: kornean sameus, turpoamine, fluoressenssivärin pysyvyys ja morfologiset muutokset (epiteelin hajoaminen) Mittaukset ennen altistusta ja 30, 75, 120, 180, ja 240 minuutin (± 5 minutes) jälkeen altistuksesta. Soveltuu mittaamaan kemikaalien tai seoste aiheuttamaa vakavaa silmävauriota (CLP kategoria 1), ei-ärsyttävyyttä, jos ei vaadi klassifikaatiota, tuotekehityksessä kemikaalien prioritisointiin. Heikko ärsyttävyys tulee tehdä OECD 405 (the Draize eye test) Tarvitaan useita testejä, jotta kanin (Draize) silmätesti voidaan korvata

11 Silmän syövytys ja ärsytys 1. Validoinnissa "SkinEthic Human Corneal Epithelium" and "EpiOcular Eye Irritation Test" 2. Kehityksen alla Ei uusia, joitain parannuksia nykyisiin esim. the Hen s Egg Test on the Chorio-allantoic Membrane (HET- CAM) assay and the Isolated Rabbit Eye (IRE) test

12

13 Valotoksisuus iholla - Reconstructed Human Epidermis Test Method Set 1 (+UV/VIS): Altistus kemikaaleille + valo Set 2 (-UV/VIS): ): ): Altistus kemikaaleille valo (pimeässä)

14 Day 3 viability assay Prediction Models: Decrease in viability (MTT-assay. Additional parameters can also be screened: IL-1, IL-8, Histology, protein content FinCopa-seminaari T. Heinonen slide from: Dr. Helena Kanďárová from MatTek IVLSL

15 In Vitro ihon ärsytys/syövytys - Reconstructed Human Epidermis Test Method, TG ihon ärsyttävyys= palautuva vaurio - Ihon syövyttävyys= palautumaton vaurio - Pohjautuu ihmisen epidermiksen solujen käyttöön( RhE, ei-transformoidut keratinosyytit). Testi kuvaa hyvin ihmisen ihon ylemmän kerroksen biokemiallisia ja fysiologisia olosuhteita eli epidermistä. - Loppupiste/End point: solujen elinkykyisyys mitattuna MTT-testillä (mittaa mitokondrioiden aktiivisuutta) - Kemikaalien altistusaika on erilainen sekä ärsyttävyyttä että syövyttävyyttä tutkittaessa, testi on sama. - Positiivinen ja negatiivinen kontrolli mukana - Inkubaatiolämpötila: C - Käyttö: ärsyttävien kemikaalien ja seosten vauriopotentiaalin identifikaatio UN GHS kategoria 2, ei-klassifioitujen kemikaalien identifikaatio. - Hyväksytään eläinkokeen korvaajaksi. FinCopa-seminaari T. Heinonen

16 Finnish Consensus Platform for Alternatives to Animal Experimentation 1. Validoinnissa: Ei ole Ihon ärsyttävyys 2. Kehityksen alla: guidance on Integrated Approaches to Testing and Assessment (IATA) for skin irritation and skin corrosion testing

17 Finnish Consensus Platform for Alternatives to Animal Experimentation Ihon herkistys 1. Hyväksytty: OECD TG 442c and OECD TG 442d 2. Validoinnissa: The human Cell Line Activation Test (h-clat)

18 AOP periaatetta noudattava testipatteri ihoherkistävyyden selville saamiseksi 1. MIE: kemikaalin reagointi ihon proteiinien kanssa, jolloin syntyy proteiini-hapteenikompleksi : Direct Peptide Reactivity Assay (DPRA). Testi on yksinkertainen proteiinisitoutumistesti. 2. Solutason vaste: Kemikaalin aiheuttaman ihon epidermiksen keratinosyyttien aktivaatio: Keratinosense-testi. Testi on yksisoluviljelmä. 3. Solutason vaste: Kemikaalin aiheuttaman ihon epidermiksen dentriittisolujen aktivaatio: H-CLAT-testi. Testi on yksisoluviljelmä. 4. Elintason vaste: Kemikaalien aiheuttama aktivoituneiden dentriittisolujen mikraatio imusolmukkeeseen ja allergeenispesifisten T- solujen jakaantumisen aktivaatio. Ei in vitrotestiä vaan LLNA-hiiritesti. FinCopa-seminaari T. Heinonen

19 Korvaa eäintestin (LLNA, TG429) FinCopa-seminaari T. Heinonen Ihoherkitsevyys: Integrated approach on testing and assessment (IATA) a specific organ/end point TG 442? TG 442? TG 442C TG 442D

20 OECD TG 442c and OECD TG 442d tämän hetkinen käyttö Testejä voidaan käyttää osana integroitua testipakettia (integrated approaches to testing and assessment,iata) erottamaan ei-herkistävät kemikaalit herkistävistä. Lisäksi REACHn alla voidaan käyttää identifioimaan ja luokittelemaan GHS kategoria 1 ihoherkistäjät. Kuitenkaan testimenetelmiä ei suositella käytettävän yksin erottamaan GHS alakategorioat 1A and 1B, toisistaan tai arvioimaan potenttisuutta. Yhdistämällä kolme testiä (TG 442C, TG 442d, h-clat) on saatu 94% tarkkuus, verrattuna 89% LLNA-testin tarkkuuteen (54 yhdisteen tutkimus) Ei toistaiseksi sovellu seoksille.

21 Muu toksisuus 1. Akuutti systeeminen 1. Validoitu: NRU hiiren soluilla (annoksen valinta akuuttia eläinkoetta varten, TG432) 2. Validoinnissa: Ei ole tällä hetkellä 2. Systeeminen pitkäaikaistoksisuus: Ei ole 3. Karsinogeenisyys: 1. Valitoitu: CTA (Cell Transformation Assay) 2. Validoinnissa: Ei ole tällä hetkellä 4. Genotoksisuus: 1. Validoitu: Useita 2. Validoinnissa: genotoksisuus ihmisen ihossa 3D testi (micronucleus test and comet assay) 5. Lisääntymis- ja kehitystoksisuus: Ei ole tällä hetkellä