POHJOISMAINEN ELINTARVIKKEIDEN METODIIKKAKOMITEA NORDIC COMMITTEE ON FOOD ANALYSIS

UDC 547.45:577.15: 543.9 POHJOISMAINEN ELINTARVIKKEIDEN METODIIKKAKOMITEA NORDIC COMMITTEE ON FOOD ANALYSIS No. 155 1996 LAKTOOSI JA GALAKTOOSI. ENTSYMAATTINEN MÄÄRITYS ELINTARVIKKEISTA LACTOSE AND GALACTOSE. ENZYMATIC DETERMINATION IN FOODS 1. TARKOITUS JA SOVELTUVUUS- ALUE Tämä entsymaattinen menetelmä on tarkoitettu laktoosin ja galaktoosin kvantitatiiviseksi määrittämiseksi elintarvikkeista. Se soveltuu erilaisille elintarvikkeille kuten nestemäisille ja kiinteille maitotaloustuotteille, lihatuotteille, leipomo- ja konditoriatuotteille, lastenruoille ja suklaalle. Menetelmä soveltuu myös laktoosittomille elintarvikkeille, mutta ei kuitenkaan tuotteille, joissa laktoosi on hydrolysoitu (ns. HYLA-tuotteet). 1.SCOPE AND FIELD OF APPLICATION This is an enzymatic method for the determination of lactose and galactose in foods. The method is applicable to various types of foods, such as liquid and solid dairy products, meat products, bakery products, cakes and pastries, baby foods and chocolate. The method is also applicable to lactose-free foods, but not to products in which the lactose has been hydrolysed (so called HYLA products). 2. PERIAATE Laktoosi hydrolysoituu D-glukoosiksi ja D-galaktoosiksi â-galaktosidaasientsyymin ja veden läsnäollessa (1). Nikotiiniamidiadeniinidinukleotidi (NAD) hapettaa D- galaktoosin galaktonihapoksi galaktoosidehydrogenaasientsyymin läsnäollessa (Gal-DH) (2). 2.PRINCIPLE In the presence of the enzyme â-galactosidase and water, lactose is hydrolyzed to D-glucose and D-galactose (1). D-galactose is oxidized to galactonic acid by nicotinamide adenine-dinucleotide (NAD) in the presence of the enzyme galactose dehydrogenase (Gal-DH) (2). â-galactosidase (1) Lactose + H 2 O D-glucose + D-galactose Gal-DH (2) D-Galactose + NAD + Galactonic acid + NADH + H + Muodostuneen NADH:n määrä (reaktio 2) on stökiometrinen laktoosin ja galaktoosin määrään nähden. NADH:n pitoisuus määritetään kvantitatiivisesti mittaamalla spektrofotometrisesti aallonpituudella 340 nm. The NADH thus formed (reaction 2) is stoichiometrically dependent on the amount of lactose and galactose. The NADH formed is quantitatively determined by measuring the absorbance of the solution spectrophotometrically at 340 nm. 3. REAGENSSIT Kaikkien reagenssien tulee olla analyysilaatua ja veden lasiastioissa kahdesti tislattua tai tislattua ja deionisoitua. 3.1 Sitraattipuskuri, (sitraatti 0,2 mol/l; Mg ++ 50 3.REAGENTS All chemicals must be of analytical grade. The water used must be double distilled or demineralized and distilled in an all-glass apparatus. 3.1 Citrate buffer, (citrate 0.2 mol/l; Mg ++ 50

NMKL menetelmä nro 155, 1996, sivu 2 (8) NMKL Method No. 155, 1996, page 2 (8) mmol/l; ph 6,6): Liuota 2,8 g trinatriumsitraattidihydraattia, 42 mg sitruunahappomonohydraattia ja 625 mg magnesiumsulfaattiheptahydraattia 40 ml:an vettä. Säädä ph arvoon 6,6±0,1 20 o C:ssa käyttäen 2 mol/l rikkihappoa tai 0,1 mol/l natriumhydroksidia. Laimenna 50 ml:ksi vedellä. Liuos säilyy kolme kuukautta +4 o C:ssa. 3.2 NAD-sitraattipuskuri (NAD n. 7 mmol/l): Liuota 25 mg nikotiiniamidiadeniinidinukleotidia (NAD) 5 ml:an sitraattipuskuria (3.1). Liuos säilyy kolme viikkoa +4 o C:ssa. 3.3 Fosfaattipuskuri (ph 8,6): Liuota 8,3 g kaliumdivetyfosfaattia n. 40 ml:an vettä. Säädä ph arvoon 8,6±0,1 20 o C:ssa käyttäen 1,0 mol/l natriumhydroksidia. Laimenna 50 ml:ksi vedellä. Liuos säilyy kaksi kuukautta +4 o C:ssa. 3.4 â-galaktosidaasi (EC 3.2.1.23) *), 5 mg/ml; 30 U/mg. Liuos säilyy yhden vuoden +4 o C:ssa. 3.5 Galaktoosidehydrogenaasi (Gal-DH) (EC 1.1.1.48) *), 5 mg/ml; 5 U/mg; 25 U/ml. Liuos säilyy yhden vuoden +4 o C:ssa. 3.6 Carrez-reagenssi I: Liuota 3,60 g kaliumheksasyanoferraattitrihydraattia (K 4 [Fe(CN) 6 ] 3H 2 O) veteen ja laimenna 100 ml:ksi. 3.7 Carrez-reagenssi II: Liuota 7,20 g sinkkisulfaattiheptahydraattia veteen ja laimenna 100 ml:ksi. 3.8 Laktoosistandardiliuos (0,500 g laktoosia/l): Kuivaa n. 1 g laktoosimonohydraattia 87±2 o C:n uunissa vakiopainoon. Punnitse 52,6 mg of kuivattua ainetta, liuota veteen ja laimenna 100 ml:ksi. Liuos säilyy yhden viikon +4 o C:ssa. mmol/l; ph 6.6): Dissolve 2.8 g trisodium citrate dihydrate, 42 mg citric acid monohydrate and 625 mg magnesium sulphate heptahydrate in 40 ml water. Adjust the ph value to 6.6±0.1 at 20 o C using 2 mol/l sulphuric acid or 0.1 mol/l sodium hydroxide. Dilute with water to 50 ml. The solution will keep for three months at +4 o C. 3.2 NAD-citrate buffer (NAD about 7 mmol/l): Dissolve 25 mg nicotinamide adenine dinucleotide (NAD) in 5 ml citrate buffer (3.1). The solution will keep for three weeks at +4 o C. 3.3 Phosphate buffer (ph 8.6): Dissolve 8.3 g potassium dihydrogen phosphate in about 40 ml water. Adjust the ph to 8.6±0.1 at 20 o C using 1.0 mol/l sodium hydroxide. Dilute with water to 50 ml. The solution will keep for two months at +4 o C. 3.4 â-galactosidase (EC 3.2.1.23) *), 5 mg/ml; 30 U/mg. The solution will keep for one year at +4 o C. 3.5 Galactose dehydrogenase (Gal-DH) (EC 1.1.1.48) *), 5 mg/ml; 5 U/mg; 25 U/ml. The solution will keep for one year at +4 o C. 3.6 Carrez' reagent I: Dissolve 3.60 g potassium hexacyanoferrate trihydrate (K 4 [Fe(CN) 6 ] 3H 2 O) in water and dilute to 100 ml. 3.7 Carrez' reagent II: Dissolve 7.20 g zinc sulphate heptahydrate in water and dilute to 100 ml. 3.8 Lactose standard solution (0.500 g lactose/l): Dry about 1 g lactose monohydrate in an oven at 87±2 o C to constant weight. Weigh 52.6 mg of the dried material, dissolve in water and dilute to 100 ml. The solution will keep for one week at +4 o C. *) Enzyme Nomenclature, American Elsevier New York 1973. The 1972 recommendations of the Commission on Enzyme Nomenclature including units and kinetic symbols. 3.9 Galaktoosistandardiliuos (0,500 g galaktoosia/l): Liuota 50,0 mg galaktoosia veteen ja laimenna 100 ml:ksi. Liuos säilyy yhden viikon +4 o C:ssa. *) Enzyme Nomenclature, American Elsevier New York 1973. The 1972 recommendations of the Commission on Enzyme Nomenclature including units and kinetic symbols. 3.9 Galactose standard solution (0.500 g galactose/l): Dissolve 50.0 mg galactose in water and dilute to 100 ml. The solution will keep for one week at +4 o C. 4. LAITTEET 4.1 Vesihaude, +70 o C. 4.2 Homogenisaattori, esim. Ultraturrax. 4. APPARATUS 4.1 Water bath, +70 o C. 4.2 Homogenizer, e.g. Ultraturrax.

NMKL menetelmä nro 155, 1996, sivu 3 (7) NMKL Method No. 155, 1996, page 3 (7) 4.3 Mikropipettejä, 20, 50, 100 ja 200 ìl. Jos käytetään automaattipipettejä, on varmistettava, että ne on oikein kalibroitu. 4.4 ph-mittari, lukematarkkuus ± 0,1 ph-yksikköä. 4.5 Spektrofotometri varustettuna kyveteillä, joiden sisäläpimitta on 1 cm. Kyvettien tulee olla materiaalista, joka sopii mittaamiseen aallonpituudella 340 nm. Laitteen tulee olla huoneenlämmössä. 4.3 Micropipettes, 20, 50, 100 and 200 ìl. If automatic pipettes with disposable tips/capillaries are used, it is important to ensure that they are properly calibrated. 4.4 ph meter, reading accuracy ± 0.1 ph units. 4.5 Spectrophotometer with cuvettes of 1 cm light path. The cuvettes must be of a material suitable for measurement at 340 nm. The instrument must be at room temperature. 5. SUORITUS 5.1 Näytteen valmistus Galaktoosin/laktoosin pitoisuus laimennetussa näytteessä ei saa ylittää 0,5 g/l. Kyvettiin pipetoitava liuos ei saa olla samea. Sameat liuokset tulee käsitellä joko hapolla tai Carrez-reagenssilla alla olevien proteiinien saostusohjeiden mukaisesti. Näyteliuoksen ph-arvon tulee olla välillä 7-9. 5.1.1 Kova juusto, liha, lihavalmisteet ja suklaa: Homogenoi näyte homogenisaattorilla (4.2). Punnitse 1 mg:n tarkkuudella 2-5 g näytettä 100 ml mittapulloon. Lisää n. 70 ml vettä. Inkuboi 15 minuuttia +70 o C vesihauteessa (4.1). Jos mahdollista, niin sekoita näytettä vesihauteessa magneettisekoittajalla tai ravistele pulloa hyvin varmistaaksesi, että näyte on tasaisesti sekoittunut pullossa. Anna liuoksen jäähtyä huoneenlämpöiseksi ja laimenna 100 ml:ksi vedellä. Rasvan erottamiseksi laita pullo jääkaappiin 20 minuutiksi. Suodata liuos (vältä pullon ravistamista ennen suodattamista). Heitä pois suodoksen ensimmäiset millilitrat. 5.1.2 Leipomo- ja konditoriavalmisteet: Käytä menetelmää 5.1.1, mutta käytä näytemäärää 5-10 g. 5.1.3 Happamat maitovalmisteet: Punnitse 1 mg tarkkuudella 2-3 g näytettä 100 ml mittapulloon, laimenna merkkiin vedellä ja sekoita hyvin. Suodata liuos (vältä pullon ravistamista juuri ennen suodattamista). Heitä pois suodoksen ensimmäiset millilitrat. 5.1.4 Sulate- ja tuorejuustot, maito- ja vellijauheet, värittömät makeat maitovalmisteet, värilliset maitotalousvalmisteet ja jälkiruoat: Punnitse 1 mg tarkkuudella 2-5 g näytettä 100 ml mittapulloon. Lisää n. 60 ml vettä ja sekoita hyvin. Jos tarpeen, niin inkuboi 15 minuuttia +70 o C vesihauteessa (kts. kohta 5.1.1). Anna liuoksen jäähtyä huoneenlämpöiseksi. 5. PROCEDURE 5.1 Treatment of samples The galactose/lactose concentration in the diluted sample must not exceed 0.5 g/l. The sample solution to be pipetted into the cuvette must not be turbid. Turbid solutions must be treated with acid or Carrez' reagent according to the procedure described below to precipitate proteins. The ph value of the sample solution must be between 7 and 9. 5.1.1 Hard cheese, meat, meat products and chocolate: Homogenize the sample with a mixer (4.2). With an accuracy of 1 mg, weigh 2-5 g sample into a 100 ml volumetric flask. Add about 70 ml water. Incubate for 15 minutes in a +70 o C water bath (4.1). If possible, stir the sample with a magnetic stirrer in the water bath or shake the flask thoroughly in order to ensure that the sample is evenly distributed in the flask. Allow the solution to cool to room temperature and dilute to 100 ml with water. To separate any fat, place the flask in a refrigerator for 20 minutes. Filter the solution (do not shake the flask immediately before filtering). Discard the first few millilitres of the filtrate. 5.1.2 Bakery products, cakes and pastries: Use the procedure described under 5.1.1, but use a sample amount of 5-10 g. 5.1.3 Acid milk products: With an accuracy of 1 mg, weigh 2-3 g sample into a 100 ml volumetric flask, dilute to the mark with water and mix thoroughly. Filter the solution (do not shake the flask immediately before filtering). Discard the first few millilitres of the filtrate. 5.1.4 Processed and soft cheese, milk and gruel powder, uncoloured sweet milk products, coloured dairy products and desserts: With an accuracy of 1 mg, weigh 2-5 g sample into a 100 ml volumetric flask. Add about 60 ml water and mix thoroughly. If necessary, incubate for 15 minutes in a +70 o C water bath (see under 5.1.1). Allow the solution to cool to

NMKL menetelmä nro 155, 1996, sivu 4 (8) NMKL Method No. 155, 1996, page 4 (8) Lisää 5 ml Carrez-reagenssia I (3.6), 5 ml Carrezreagenssia II (3.7) ja 10 ml 0,1 mol/l natriumhydroksidia. Anna näytteen seistä 30 minuuttia ja laimenna 100 ml:ksi vedellä. Rasvan poistamiseksi katso kohta 5.1.1. Suodata liuos (vältä pullon ravistamista ennen suodattamista). Heitä pois suodoksen ensimmäiset millilitrat. 5.2 Määritys Suorita määritys 1 cm kyveteissä ja käytä 100 ìl näytetilavuutta. Jos käytät muuta näytetilavuutta, niin muuta lisättävän veden määrää siten, että näytteen, entsyymin (3.4) ja veden yhteistilavuus on 2,05 ml. Kaikkien kyvettiin lisättävien reagenssien tulee olla huoneenlämpöisiä (20-25 o C). Pipetoi kyvetteihin: room temperature. Add 5 ml Carrez' reagent I (3.6), 5 ml Carrez' reagent II (3.7) and 10 ml 0.1 mol/l sodium hydroxide. Let the sample stand for 30 minutes and dilute to 100 ml with water. For the separation of fat, see the procedure under 5.1.1. Filter the solution (do not shake the flask immediately before filtering). Discard the first few millilitres of the filtrate. 5.2 Determination Perform the determination in a 1 cm cuvette and use a sample volume of 100 ìl. If another volume is used, adjust the amount of water to be added so that the total volume of sample, enzyme (3.4) and water is 2.05 ml. All reagents added to the cuvette must be at room temperature (20-25 o C). Pipette into cuvettes: Blank Sample Blank Sample lactose lactose galactose galactose NAD/citrate buffer (3.2) 0.20 ml 0.20 ml 0.20 ml 0.20 ml â-galactosidase (3.4) 0.02 ml 0.02 ml - - Sample or standard solution (3.8), (3.9) - 0.10 ml - 0.10 ml HUOM. Kaupallisen määrityskitin â-galaktosidaasin pitoisuus saattaa olla 60 U/ml eikä 150 U/ml, jolloin lisättävän â-galaktosidaasin määrä on 0,05 ml. Sekoita varovasti, mutta hyvin jokaisen kyvetin sisältö. Inkuboi kyvettejä 20-25 o C:ssa 15 minuuttia. Pipetoi sitten kyvetteihin: Note that the â-galactosidase of commercial test kits may be at a concentration of 60 U/ml and not 150 U/ml, which means that the amount of â- galactosidase to be added is 0.05 ml. Mix carefully but thoroughly the contents of each cuvette. Incubate the cuvettes at 20-25 o C for 15 minutes. Then pipette into the cuvettes: Blank Sample Blank Sample lactose lactose galactose galactose Phosphate buffer (3.3) 1.00 ml 1.00 ml 1.00 ml 1.00 ml Water 2.03 ml 1.93 ml 2.05 ml 1.95 ml Sekoita varovasti, mutta hyvin. Kahden minuutin kuluttua lue näytteiden ja nollien absorbanssi A1 ilmaa vastaan aallonpituudella 340 nm. Merkitse absorbanssit seuraavasti: A1b kok lakt = laktoosin nollakyvetissä olevan A1 kok lakt = laktoosin näytekyvetissä olevan liuoksen absorbanssi A1b gal = galaktoosin nollakyvetissä olevan A1 gal = galaktoosin näytekyvetissä olevan Mix carefully but thoroughly. After two minutes, read the absorbances A1 against air of samples and blanks at 340 nm. Record the absorbances as: A1b tot lact =absorbance of solution in the blank A1 tot lact =absorbance of solution in the sample A1b gal =absorbance of solution in the blank ga A1 gal =absorbance of solution in the sample ga

NMKL menetelmä nro 155, 1996, sivu 5 (7) NMKL Method No. 155, 1996, page 5 (7) Lisää joka kyvettiin 0,050 ml galaktoosidehydrogenaasiliuosta (Gal-DH) (3.5). Sekoita varovasti, mutta hyvin. 25 minuutin kuluttua lue näytteiden ja nollien absorbanssi A2 ilmaa vastaan aallonpituudella 340 nm. Merkitse absorbanssit seuraavasti: A2b kok lakt = laktoosin nollakyvetissä olevan liuoksen absorbanssi A2 kok lakt = laktoosin näytekyvetissä olevan A2b gal = galaktoosin nollakyvetissä olevan A2 gal = galaktoosin näytekyvetissä olevan Jos reaktio ei ole pysähtynyt n. 25 minuutin kuluttua (tätä kutsutaan "ryömimisreaktioksi"), jatka absorbanssien lukemista kahden minuutin välein ja laske absorbanssi A2 allamainitun "ryömimisreaktio"- esimerkin mukaan. Esimerkki A2:n laskemisesta "ryömimisreaktiossa": A1 = 0,150 A2 (20') = 0,500 A2 (22') = 0,530 A2 (24') = 0,540 A2 (26') = 0,550 A2 (28') = 0,560 ÄA/Ät = vakio = 0,010/2' A2 = 0,560 - (28'/2' 0,010) = 0,560-0,140 = 0,420 Add to all cuvettes 0.050 ml galactose dehydrogenase (Gal-DH) solution (3.5). Mix carefully but thoroughly. After 25 minutes, read the absorbances A2 against air of samples and blanks at 340 nm. Record the absorbances as: A2b tot lact =absorbance of solution in the blank A2 tot lact =absorbance of solution in the sample A2b gal =absorbance of solution in the blank galactose cuvette A2 gal =absorbance of solution in the sample ga If the reaction has not stopped after about 25 minutes (this is called a "creeping" reaction), continue to read absorbances at intervals of two minutes and calculate the absorbances A2 in accordance with the example "Creeping reaction" given below. Example of calculating A2 in a "creeping reaction": A1 = 0.150 A2 (20') = 0.500 A2 (22') = 0.530 A2 (24') = 0.540 A2 (26') = 0.550 A2 (28') = 0.560 ÄA/Ät = constant = 0.010/2' A2 = 0.560 - (28'/2' 0.010) = 0.560-0.140 = 0.420 6. TULOSTEN LASKEMINEN Laske näytteiden ja nollien absorbanssierot (A2-A1): ÄA nolla kok lakt = A2b kok lakt - A1b kok lakt ÄA näyte kok lakt = A2 kok lakt - A1 kok lakt ÄA kok lakt = ÄA näyte kok lakt - ÄA nolla kok lakt ÄA nolla gal ÄA näyte gal = A2b gal - A1b gal = A2 gal - A1 gal 6. CALCULATION OF RESULTS Calculate the differences in absorbances (A2-A1) for sample and blank: ÄA blank tot lact = A2b tot lact - A1b tot lact ÄA sample tot lact = A2 tot lact - A1 tot lact ÄA tot lact = ÄA sample tot lact - ÄA blank tot lact ÄA blank gal = A2b gal - A1b gal ÄA sample gal = A2 gal - A1 gal ÄA gal = ÄA näyte gal - ÄA nolla gal ÄA lakt = ÄA kok lakt - ÄA gal ÄA gal ÄA lact = ÄA sample gal - ÄA blank gal = ÄA tot lact - ÄA gal Yleiskaava pitoisuuden laskemiseen on: c (g/100 ml näyteliuosta) = [(V MW)/(å d v 1000 10)] ÄA The general formula for calculating the concentrations is: c (g/100 ml sample solution) = [(V MW)/(å d v 1000 10)] ÄA

NMKL menetelmä nro 155, 1996, sivu 6 (8) NMKL Method No. 155, 1996, page 6 (8) missä V = kyvetin nesteen lopputilavuus (ml) (3,30 ml) MW = analyytin molekyylipaino (mg/mmol) (342,3 laktoosille, 180,2 galaktoosille) å = NADH:n absorptiokerroin 340 nm:ssa (= 6,3 l/(mmol cm)) d = kyvetin sisäläpimitta (cm) (1 cm) v = näytteen tilavuus (ml) kyvetissä (0,1 ml) 1000 = 1000 mg = 1 g ÄA = absorbanssiero 10 = muunnoskerroin muunnettaessa g/l -> g/100 g. Laske laktoosin pitoisuus näytteessä (g/100 g) kertomalla pitoisuus c laimennoskertoimella, joka saadaan ottamalla huomioon näytteen esikäsittelyt. Esimerkki: Punnittu 2,123 g:n näyte. Se on laimennettu 100 ml:ksi. Laimennoskerroin S = 100/2,123 = 47,10. Laktoosi (g/100 g) = c S (MW = 342,3) Galaktoosi (g/100 g) = c S (MW = 180,2) where V =final volume (ml) in the cuvette (3.30 ml) MW =molecular weight (mg/mmol) of the analyte (342.3 for lactose, 180.2 for galactose) å =absorption coefficient of NADH at 340 nm (= 6.3 l/(mmol cm)) d = length (cm) of the cuvette (1 cm) v = sample volume (ml) in the cuvette (0.1 ml) 1000 = 1000 mg = 1 g ÄA =the difference in absorbance 10 =conversion factor to convert g/l to g/100 g. Calculate the concentration of lactose in the sample (g/100 g) by multiplying the concentration c by a dilution factor corresponding to the performed sample pretreatment. Example: A sample of 2.123 g was weighed. It was diluted to 100 ml. Dilution factor S = 100/2.123 = 47.10. Lactose (g/100 g) = c S (MW = 342.3) Galactose (g/100 g) = c S (MW = 180.2) 7. HUOMAUTUKSIA 1. Jos laktoosin ja galaktoosin pitoisuus näyteliuoksessa ylittää 0,5 g/l, tulee liuos laimentaa ennen määritystä tai tulee käyttää pienempää näytetilavuutta (5.2). 2. Tarkkuuden vuoksi työ tulisi, jos mahdollista, suorittaa siten, että ÄA-arvot ovat välillä 0,1 ja 0,8. Kuitenkin ÄA-arvoja, jotka ovat suurempia kuin 0,020, voidaan pitää luotettavina. 3. Monet elintarvikkeet eivät sisällä galaktoosia. Määritettäessä laktoosia sellaisista elintarvikkeista riittää, kun määritetään vain kokonaislaktoosipitoisuus. Määritettäessä alhaisia galaktoosipitoisuuksia on joskus tarpeen analysoida erillinen, vähemmän laimennettu näyte. 4. Tämä menetelmä ei sovellu elintarvikkeille, joista laktoosi on entsymaattisesti hydrolysoitu glukoosiksi ja galaktoosiksi. Näytteitä, jotka sisältävät yli viisi kertaa enemmän galaktoosia kuin laktoosia, on vaikea analysoida tällä menetelmällä. Tämä menetelmä on periaatteeltaan samanlainen kuin menetelmä, mikä on kuvattu julkaisussa "Methods of Biochemical Analysis and Food Analysis using Test- Combinations", Boehringer Mannheim, 1989. Kaupallinen analyysikitti on saatavissa esim. Boehringer Mannheimilta. 7. NOTES 1. If the concentrations of lactose and galactose in the sample solution exceed 0.5 g/l, the solution must be diluted before the determination or a smaller sample volume must be used (5.2). 2. For reasons of precision the work should, if possible, be carried out aiming at ÄA values between 0.1 and 0.8. However, ÄA values over 0.020 may be considered reliable. 3. Many foods do not contain galactose. When determining lactose in such foods it is sufficient to determine total lactose only. When determining low concentrations of galactose, it is sometimes necessary to analyse a separate, less diluted sample. 4. This method is not applicable to foods containing lactose which has been hydrolyzed to glucose and galactose using enzymes. In general, difficulties may be expected in the case of samples containing more than five times more galactose than lactose. This method is similar in principle to the method described in "Methods of Biochemical Analysis and Food Analysis using Test-Combinations", Boehringer Mannheim, 1989. The commercial analytical kit is available e.g. from Boehringer Mannheim.

NMKL menetelmä nro 155, 1996, sivu 7 (7) NMKL Method No. 155, 1996, page 7 (7) 8. MENETELMÄN LUOTETTAVUUS Menetelmä on testattu menetelmätutkimuksessa, johon osallistui 12 laboratoriota neljästä eri maasta. Tutkimuksessa oli näytteinä kuusi yleisesti esiintyvää elintarviketta, joiden laktoosipitoisuudet olivat välillä 0,4-40 g/100 g ja galaktoosipitoisuudet <0,7 g/100 g. Näytemateriaalit olivat näkkileipä, maitosuklaa, makkara, juusto, margariini ja maitojauhetta sisältävä lastenruoka. Ne lähetettiin 12 osallistujalle 12 satunnaisesti numeroituina testinäytteinä, joissa oli kuudesta materiaalista kätketyt rinnakkaisnäytteet. Suhteelliset standardipoikkeamat uusittavuudelle (RSD R ) vaihtelivat laktoosin määrityksessä välillä 2,3 ja 11 %, ja galaktoosin määrityksessä välillä 6,8 ja 50 %. Menetelmän määrittämisraja riippuu siitä, miten hyvin laktoosi ja galaktoosi saadaan uutettua näytteestä ja siitä, miten luotettavia arvoja saadaan ÄA:lle. Optimioloissa voidaan määrittää pitoisuuksia, jotka ovat alle 100 mg/kg. Täydellinen tutkimusselostus on lähetetty julkaistavaksi lehdessä Journal of AOAC INTERNATIONAL. 8. RELIABILITY OF THE METHOD The method was studied in an interlaboratory methods performance study with 12 participating laboratories from four countries. Six materials of commonly used foodstuffs with lactose concentrations varying between about 0.4 g/100 g and about 40 g/100 g and galactose concentrations up to 0.7 g/100 g were included in the study. The materials were crisp rye bread, milk chocolate, sausage, cheese, margarine and baby food containing milk powder. They were distributed to the 12 partic i- pants as 12 randomly numbered test samples, which were blind duplicates of the six materials. The relative standard deviations for reproducibility (RSD R ) for the determination of lactose was estimated to vary between 2.3 and 11 %, and for galactose between 6.8 and 50 %. The limit of determination of this method depends on the completeness of the extraction of lactose and galactose present in the sample, and on whether reliable values are obtained for ÄA. Under optimal conditions it is possible to determine concentrations down to lower than 100 mg/kg. The complete study report has been submitted for publication in Journal of AOAC INTERNATIONAL. 9. MENETELMÄN REFERENTIT Tämän menetelmän on ensin kehittänyt Carola Östman, Valio T&K, Helsinki. Menetelmän kokeilun ja raportoinnin on tehnyt Antti Mustranta, VTT Bio- ja elintarviketekniikka, Espoo. 9.REFEREES OF THE METHOD This method was first elaborated by Carola Östman of Valio R&D Centre in Helsinki, Finland. The method-performance study and its reporting was undertaken by Antti Mustranta of VTT Biotechnology and Food Research in Espoo, Finland.