UDC 615.917:54.06 POHJOISMAINEN ELINTARVIKKEIDEN METODIIKKAKOMITEA NORDIC COMMITTEE ON FOOD ANALYSIS No 143 2. painos 2nd ed. 1997 OKRATOKSIINI A. NESTEKROMATO- GRAFINEN MÄÄRITYS VILJASTA JA VILJAVALMISTEISTA OCHRATOXIN A. LIQUID CHROMATO- GRAPHIC DETERMINATION IN CEREALS AND CEREAL PRODUCTS 1. TARKOITUS JA SOVELTAMISALA Menetelmä soveltuu okratoksiini A:n (OTA) määritykseen viljasta ja viljavalmisteista 2 ng/g suurempina pitoisuuksina. 2. PERIAATE OTA uutetaan kloroformi-laimea fosforihappoliuoksella ja rikastetaan uuttamalla siitä bikarbonaattiliuokseen. Liuos laitetaan C18 kolonniin, josta OTA eluoidaan etyyliasetaatti-metanoli-etikkahappoliuoksella. OTA tunnistetaan käännettyfaasi-nestekromatografialla ja määritetään fluorometrisesti. Osoitus varmistetaan OTA:n metyylijohdoksen kromatografoinnilla. 1. SCOPE AND FIELD OF APPLICATI- ON The method is applicable to the analysis of ochratoxin A (OTA) in cereals and cereal products in concentrations above 2 ng/g. 2. PRINCIPLE OTA is extracted with chloroform-aqueous phosphoric acid and isolated by liquid-liquid partitioning into aqueous bicarbonate solution. The solution is applied to a C18 column, and OTA is eluted with ethyl acetate-methanol-acetic acid. The OTA is identified by reversed phase LC and quantified by fluorescence. Chromatography of OTA methyl ester derivative confirms the identification. 3. LAITTEISTO 3.1 Tehosekoitin kannellisella 1250 ml astialla. 3.2 Nestekromatografi. Pumppu, jossa virtausnopeus 0,5 ml/min:stä 5 ml/min. asti 3000 psi paineella. Virtauksen toistettavuus ±0,1%. Injektori 25 µl näytekierukalla, fluoresenssidetektori sekä sopiva piirturi tai integraattori. 3.3 Analyyttinen nestekromatografia (LC) kolonni. 250 mm pituus ja 4,6 mm sisähalkaisija, täytteenä pyöreä 5 µm C18 materiaali (Supelco Inc., Bellafonte, PA 16823, tai vastaava). 3. APPARATUS 3.1 High-speed blender. 1250 ml jar with cover. 3.2 Liquid chromatograph. Pump with variable flow from 0.5 to 5 ml/min., at up to 3000 psi. Flow reproducibility ±0.1%. Injection valve with 25 µl loop, fluorescence detector, compatible recorder or integrator. 3.3 LC analytical column. 250x4.6 mm i.d., packed with spherical 5 µm C18 material (Supelco Inc., Bellafonte, PA 16823, or equivalent).
sivu 2 (6) page 2 (6) 3.4 Adsorptiokolonni. 500 mg 40 µm C18 materiaalia 3 ml:n propyleeniputkessa (Supelco Inc. tai vastaava). 3.5 Alipainekammio, jonka aukoissa hanat C18 kolonneja varten. Kammion sijasta voidaan käyttää injektioruiskua (5-10 ml), jossa sopiva adapteri (Luer). 3.6 Lasikuitusuodatin. 0,33 mm paksuus, 1,5 µm huokoskoko, 9,0 cm halkaisija (Whatman no 934 AH tai vastaava). 3.7 Mikrosuodatin. 0,45 µm huokoskokoinen ruiskuun liitettävä (Gelman acrodisc 3CR PTFE tai vastaava). 3.4 Adsorption column. 500 mg 40 µm C18 material in 3 ml polypropylene tube (Supelco, Inc., or equivalent. 3.5 Vacuum manifold with stopcocks at each port for holding C18 columns. Can be replaced by a syringe (5-10 ml) with a suitable adapter (Luer). 3.6 Glass fiber filters. 0.33 mm thickness, 1.5 µm pore retention, 9.0 cm diameter (Whatman No. 934 AH, or equivalent). 3.7 Microfilter. 0.45 µm pore retention syringe filter (Gelman acrodisc 3CR PTFE, or equivalent). 4. REAGENSSIT 4.1 Liuottimet. Kloroformi, dikloorimetaani, etyyliasetaatti, tolueeni ja metanoli, "pro analysi"-laatu, lasiastioissa. Asetonitriili, LC-laatu. 4.2 Kemikaalit. Fosforihappo, natriumbikarbonaatti, etikkahappo (kaikki "pro analysi"-laatua). Kaikki liuokset valmistetaan tislattuun veteen. 4.3 Suodatusapuaine. Liota noin 900 g happopestyä Celite 545:tä yön yli metanolissa. Suodata kaksinkertaisen Whatman no 1 paperin läpi 24 cm Büchner-suppilossa, pese 8 l:lla vettä ja kuivata 12 tuntia 150 o C. 4.4 LC-liikkuva faasi. Vesi-asetonitriili-etikkahappo (99+99+2). Käytä nestekromatografiaan sopivaa vettä. Poista ilma. 4.5 Fosforihappoliuos, 0,1 mol/l. Laimenna 5,75 g 85% fosforihappoa 500 ml:ksi vedellä. 4.6 OTA standardiliuokset. Noin 24 µg/ml tolueeni-etikkahapossa (99+1). Mittaa UV-absorbanssi (333 nm, ε = 5440, MW = 403) tarkan pitoisuuden määrittämiseksi. Laimenna kantaliuos tolueeni-etikkahapolla (99+1) saadaksesi käyttöstandardin (4 µg/ml). 4.7 BF 3 -metanoli-liuos. 14% BF 3 metanolissa. Varoitus: Käytä vetokaappia ja vältä kosketusta ihon, silmien tai hengitystiehyeiden kanssa. 4. REAGENTS 4.1 Solvents. Chloroform, dichloromethane, ethyl acetate, toluene and methanol, pro analysi, in glass. Acetonitrile, LC grade. 4.2 Chemicals. Phosphoric acid, sodium bicarbonate, acetic acid, pro analysi. All solutions are prepared using distilled water. 4.3 Diatomaceous earth. Soak about 900 g acidwashed Celite 545 overnight in methanol. Filter through a double layer of Whatman No. 1 paper in a 24 cm Buchner funnel, wash with 8 l water and dry for 12 hours at 150 o C. 4.4 LC mobile phase. Water-acetonitrile-acetic acid (99+99+2). Use LC grade water. Degas. 4.5 Phosphoric acid solution, 0.1 mol/l. Dilute 5.75 g 85% phosphoric acid to 500 ml with water. 4.6 OTA standard solutions. About 24 µg/ml in toluene-acetic acid (99+1). Measure UV absorbance (333 nm, ε = 5440, MW = 403) to determine the exact concentration. Dilute the stock solution with toluene-acetic acid (99+1) solution to obtain a working standard solution (4 µg/ml). 4.7 BF 3 -methanol solution. 14% BF 3 in methanol. Caution: Use in hood. Avoid contact with skin, eyes, and respiratory tract.
sivu 3 (6) page 3 (6) 5. SUORITUS 5.1 Näytteen valmistus: Jauha näyte niin, että se läpäisee 1,0 mm seulan. Sekoita tasalaatuiseksi. 5.2. Uutto: Punnitse 50 g näyte sekoittimen (3.1) astiaan ja lisää ensin 250 ml kloroformia ja sitten 25 ml 0,1 mol/l fosforihappoa (4.5). Sekoita 3 min. keskinkertaisella nopeudella. Sekoituksen loppuvaiheessa lisää 10 g (45 ml) Celite 545:tä (4.3). Suodata uute läpi lasikuitusuodattimen (3.6), joka on 9 cm Büchner-suodattimessa ja jonka päällä on 10 g Celite 545:tä (tai suodata tavanomaisesti 32 cm laskostetun suodatinpaperin läpi). Kerää >50 ml suodosta. 5.3 Rikastus: Siirrä 50 ml suodosta erotussuppiloon. Lisää 10 ml 3% natriumbikarbonaattiliuosta ja sekoita varovaisesti. Anna faasien erota. Jos emulsio muodostuu, sentrifugoi 2 min. 2000 rpm. Ota talteen ylempi (bikarbonaatti) faasi kolonniuuttoa varten. 5.4 Kolonnin aktivointi: Liitä C18 kolonni (3.4) aukkoon alipainekammiossa, jossa on 25 ml erlenmeyerpullot tai dekantterit aktivointi- ja huuhteluliuosten keräämiseksi. Pese jokainen kolonni 2x2 ml:lla metanolia sitten 2x2 ml:lla vettä ja 2x2 ml:lla 3% natriumbikarbonaattia. ÄLÄ ANNA KOLON- NIN KUIVUA. Käytä kevyttä imua nopeuttaaksesi eluutiota. Myös ylipainetta voidaan käyttää kiinnittämällä 5-10 ml ruisku kolonnin yläpäähän. Jätä noin 2 mm liuotinta kolonnin täytemateriaalin päälle. 5.5 Kolonniuutto: Pipetoi 5 ml bikarbonaattiuutosta kohdasta 5.3 C18 kolonniin. Älä päästä kolonnia kuivaksi. Pese 2 ml:llä 0,1 mol/l fosforihappoa ja sitten 2 ml:lla vettä. Heitä pesuliuokset pois. Eluoi OTA 8 ml:lla etyyliasetaatti-metanoli-etikkahappoa (95+5+0,5) Kerää eluaatti 10 ml:n koeputkeen, jossa on 2 ml vettä. Heiluta tai sekoita eluaattia lasisauvalla, jotta kaksi faasia sekoittuvat. Pipetoi OTA uute (ylempi faasi) toiseen kierrekorkilliseen 10 ml:n koeputkeen. Huuhtele loppu ylemmästä faasista koeputkesta kahdesti 1 ml:lla etyyliasetaattia ja lisää OTA faasiin. Jatka kohdan 5.6.3 mukaan. Käytetyt C18 kolonnit voidaan regeneroida kohdan 5.4 menettelyn mukaisesti. 5.PROCEDURE 5.1 Sample preparation: Grind the sample to pass a 1.0 mm sieve. Blend. 5.2. Extraction: Weigh 50 g test portion into a blender jar (3.1) and add first 250 ml chloroform and then 25 ml 0.1 mol/l phosphoric acid (4.5). Blend for 3 min. at medium speed. Near the end of blending add 10 g (45 ml) diatomaceous earth (4.3). Filter the extract through glass fiber filter (3.6) covered with about 10 g diatomaceous earth on a 9 cm Buchner funnel (or by gravity through a 32 cm fluted paper). Collect >50 ml filtrate. 5.3 Partition: Transfer 50 ml of filtrate to a separation funnel. Add 10 ml 3% sodium bicarbonate solution and shake gently. Allow the phases to separate. If an emulsion forms, centrifuge 2 min. at 2000 rpm. Collect the upper (bicarbonate) phase for column extraction. 5.4 Column preparation: Attach the C18 columns (3.4) to vacuum manifold ports with 25 ml Erlen meyer flasks or beakers inside the manifold for collecting conditioning and washing solvents. Wash each column twice with about 2 ml methanol, 2 ml water, and 2 ml 3% sodium bicarbonate. DO NOT ALLOW THE COLUMN TO RUN DRY. To speed elutions, apply gentle suction. This procedure may also be performed manually by applying pressure with a 5-10 ml syringe adapted to the top of the column. Leave about 2 mm solvent on top of the frit. 5.5 Column extraction: Pipette 5 ml of the bicarbonate extract from 5.3 to the C18 column. Do not allow the column to run dry. Wash with 2 ml 0.1 mol/l phosphoric acid followed by 2 ml water. Discard the washing liquids. Elute OTA with 8 ml ethyl acetate-methanol-acetic acid (95+5+0.5). Collect the eluate in a 10 ml test tube containing 2 ml water. Shake or stir the eluate with a glass rod to mix the two phases. Pipette OTA extract (upper phase) into another 10 ml test tube with a screw-cap. Wash the remaining upper phase from the tube with 2x1 ml ethyl acetate and add to the OTA phase. Continue as described under 5.6.3. Used C18 columns may be regenerated by following the procedure under 5.4.
sivu 4 (6) page 4 (6) 5.6 LC määritys 5.6.1 Kromatografiset olosuhteet: Aseta virtaus 1,0 ml/min. Valitse sellainen herkkyys, että 1,0 ng OTA:n vaste on 4-8% koko asteikosta ja kohina <2%. Viipymä on 10-13 min. Käytä 20-25 µl injisointitilavuutta ja 50 µl näytetilavuutta 25 µl näytekierukkaan. Käytä hilallisella fluoresenssidetektorilla 333 nm eksitaatiota ja 460 nm emissiota, suodattimilla varustetulla fluoresenssidetektorilla käytä 420 nm cut-off suodatinta. 5.6.2 Standardisuora: Tee standardisuora analyysien aluksi ja aina kun kromatografiset olosuhteet muuttuvat. Siirrä kiinteätilavuuksisilla ruiskuilla 2, 3, 5, 10 ja 25 µl käyttöstandardiliuosta (4 ng/µl) erillisiin 4-5 ml:n kierrekorkillisiin putkiin, joiden korkeissa on teflontiiviste. Haihduta juuri kuivaksi asti typellä. Lisää 1,00 ml LC-liikkuvaa faasia (4.4) jokaiseen astiaan saadaksesi lopulliset OTA-pitoisuudet 0,2, 0,3, 0,5, 1,0 ja 2,5 ng/25 µl. Kromatografoi kukin standardi. Laske (normalisoi) vaste (R 1-5 ) 1 ng OTA:a kohden kullekin viidestä standardin pitoisuudesta (C 1-5 ). Laske näiden viiden standardin vasteen keskiarvo ja määritä prosentuaalinen poikkeama (D) keskiarvosta kullekin arvolle seuraavasti: R a = (R 1 /C 1 + R 2 /C 2 + R 3 /C 3 + R 4 /C 4 )/4 D = 100 ((R/C) - R a )/R a Poikkeaman tulee olla 5%. Mikäli D>5, hylkää yksi arvo ja laske uudelleen R a neljän standardin avulla. Mikäli nämä neljä arvoakaan eivät ole hyväksyttäviä, kromatografoi standardiliuokset uudelleen tai valmista uudet standardiliuokset ja kromatografoi ne. Kun poikkeamavaatimus on täytetty, piirrä standardisuora piikkien korkeus tai pinta-ala 0,2, 0,3, 0,5, 1,0 ja 2,5 ng OTA-määrää vasten käyttäen origoa nollakohtana. 5.6.3 Näyte. Haihduta kohdassa 5.3 saatu uute juuri kuivaksi asti typellä vesihauteessa. Liuota se sitten välittömästi 500 µl:aan liikkuvaa faasia (4.4) ja suodata 0,45 µm suodattimen läpi 5 ml:n kierrekorkilliseen putkeen. Kromatografoi näyte välittömästi. Tunnista OTA viipymän perusteella (sen tulee olla sama kuin standardilla). Jos näytteen OTA:n vaste on standardisuoran vastealueen ulkopuolella sovita näyteliuoksen tilavuudella pitoisuus väkevämmäksi tai laimeammaksi. Säästä loput näyteliuoksesta OTA:n tunnistuksen varmistukseen 5.6 LC determination 5.6.1 Operating conditions: Adjust the flow rate to 1.0 ml/min. Select the sensitivity to give 4-8% of full scale response for 1.0 ng OTA and <2% noise. The retention time is 10-13 min. Use an injection volume of 20-25 µl and use 50 µl to fill the 25 µl loop. For fluorescence detectors with gratings, set the excitation at 333 nm and the emission at 460 nm; for fluorescence detectors with filters, use a 420 nm cut-off filter. 5.6.2 Standard curve: Prepare a standard curve at the start of the analysis and whenever the chromatographic conditions change. Dispense 2, 3, 5, 10, and 25 µl aliquots of working standard solution (4 ng/µl) into separate 4-5 ml Teflon-lined screwtopped vials using fixed-volume syringes. Evaporate just to dryness under nitrogen. Add 1.00 ml LC mobile phase (4.4) to each vial for final OTA concentrations of 0.2, 0.3, 0.5, 1.0 and 2.5 ng/25 µl. Chromatograph each standard solution. Calculate (normalize) the response (R 1-5 ) of 1 ng OTA for each of the five standard concentrations (C 1-5 ). Calculate the mean response (R a ) for the five standard concentrations and determine the percentage deviation (D) of individual values from the mean as follows: R a = (R 1 /C 1 + R 2 /C 2 + R 3 /C 3 + R 4 /C 4 + R 5 /C 5 )/5 D = 100 ((R/C) - R a )/R a The deviation should be 5%. If D>5, omit one value and recalculate R a using four standards. If four values do not agree, rechromatograph the standard solutions or prepare new standard solutions. When the deviation is acceptable plot peak heights or areas vs. 0.2, 0.3, 0.5, 1.0 and 2.5 ng OTA for linearity using the origin (0;0) as a fixed point. 5.6.3 Sample: Evaporate the extract from 5.3 just to dryness on a steam bath under nitrogen. Then immediately dissolve in 500 µl of the mobile phase (4.4) and filter through a 0.45 µm microfilter into a 5 ml screw-cap vial. Immediately chromatograph the sample. Identify OTA from the retention time (which must be the same as that of standard OTA). If the sample OTA response is outside the range of the standard curve, adjust the sample volume by concentrating or diluting the sample solution. Reserve the remaining sample solution for identity
sivu 5 (6) page 5 (6) tekemällä sen metyyliesteri. Laske OTA:n pitoisuus näytteessä seuraavasti: OTA (ng/g) = (R s xv T )/(R a xv 1 xw) = (R s xf)/r a W = (50 g x 50 ml x 5 ml)/250 ml x 10 ml) = 5 g (lopullista näytettä vastaava näytteen massa) R s = injisoidun näytteen vaste R a = laskettu normalisoitu vasteen keskiarvo (1 ng OTA:a vaste) viiden (neljän) käyttöstandardiliuoksen perusteella (5.1.1). V T = lopullisen näyteliuoksen tilavuus V I = näytteen injisointitilavuus (25 µl) F = 4 confirmation by formation of methyl ester. Calculate the OTA concentration in the sample as follows: OTA (ng/g) = (R s xv T )/(R a xv 1 xw) = (R s xf)/r a W =(50 g x 50 ml x 5 ml)/250 ml x 10 ml) = 5 g (weight of test sample represented by final extract) R s =response of test sample injected R a =calculated mean normalized respons (response for 1 ng OTA) of the five (four) working standard solution concentrations (5.1.1) V T =final test sample volume (500 µl) V I =volume of test sample injected (25 µl) F =4 6. OTA:N VARMENTAMINEN Siirrä kvantitatiivisesti loput säästetystä näytteestä (5.6.3) 25 ml erotussuppiloon käyttäen 3x1 ml dikloorimetaania astian huuhteluun. Sekoita ja anna faasien erota. Kerää alempi faasi 5 ml putkeen ja haihduta kuivaksi. Siirrä 50 µl OTA:n käyttöstandardia toiseen 5 ml putkeen ja haihduta kuivaksi. Lisää 0,5 ml 14% BF 3 -metanolia kumpaankin putkeen, sulje putket ja kuumenna 15 min. 50-60 o C vesihauteessa. Haihduta typellä kuivaksi vesihauteessa. Mikäli vettä jää jäljelle, lisää 1 ml asetonitriiliä ja haihduta kuivaksi. Jäähdytä ja laimenna liikkuvalla faasilla samaan tila vuuteen kuin LC-analyysissä. Kromatografoi derivatisoitu näyte ja standardi. Myönteisessä varmennuksessa OTA:n viipymällä (10-12 min.) oleva piikki häviää ja uusi piikki ilmestyy standardin metyyliesterin viipymällä (noin 15 min. myöhemmin). 6. CONFIRMATION OF OTA Quantitatively transfer the remaining reserved sample (5.6.3) to a 25 ml separation funnel, using 3x1 ml dichloromethane to rinse the vial. Shake and allow the layers to separate. Collect the lower layer into a 5 ml vial and evaporate to dryness. Transfer 50 µl working standard solution to another 5 ml vial and evaporate to dryness. Add 0.5 ml 14% BF 3 -methanol to each vial, cap and heat for 15 min. in a 50-60 o C water bath. Evaporate to dryness on a steam bath under nitrogen. If water is present, add 1 ml acetonitrile and continue evaporation to dryness. Cool and dilute with mobile phase to the same volume as used for LC analysis. Chromatograph the derivatized sample and standard. Positive confirmation is provided by disappearance of the peak at the R t for OTA (10-12 min.) and appearance of a new peak at the same R t as that of the standard methyl ester of OTA (about 15 min. later). 7. MENETELMÄN LUOTETTAVUUS 7.1 Ensimmäinen laboratorioiden välinen kokeilu Tämä menetelmä on ensin tutkittu laboratorioiden välisessä vertailussa AOAC INTERNATIONAL:in toimesta yhteistyössä International Union of Pure and Applied Chemistryn (IUPAC) ja Pohjoismaisen elintarvikkeiden metodiikkakomitean (NMKL) kanssa. Kaikkiaan 16 laboratoriota Euroopasta, Kanadasta ja Yhdysvalloista osallistui tutkimukseen. 7. RELIABILITY OF THE METHOD 7.1 First interlaboratory study This method was first collaboratively studied in an interlaboratory study conducted by AOAC INTER- NATIONAL in cooperation with the International Union of Pure and Applied Chemistry (IUPAC) and the Nordic Committee on Food Analysis (NMKL). A total of 16 laboratories in Europe, Canada and the United States participated in the study. OTA was
sivu 6 (6) page 6 (6) OTA:a oli lisätty ohraan ja maissiin 10, 20 ja 50 ng/kg. Keskimääräiset OTA:n saannot vaihtelivat 72%:sta 82%:iin. Laboratorioiden sisäiset suhteelliset keskihajonnat olivat 7,9% ohralle ja 20,1% maissille. Laboratorioiden väliset suhteelliset keskihajonnat olivat 20,7-31,7 % kaikille OTA:n pitoisuuksille. Viite vertailuraporttiin: Journal of AOAC INTERNATIONAL 75 (1992):3, 481-487. added to barley and maize at 10, 20 and 50 ng/g. Mean recoveries of OTA ranged from 72 to 82%. Within-laboratory relative standard deviations were 7.9% and 20.1% for barley and maize, respectively. Between-laboratory relative standard deviations were 20.7-31.7% for all concentrations of OTA. Reference to the study report: Journal of AOAC INTERNATIONAL 75 (1992):3, 481-487. 7.2 Toinen laboratorioiden välinen kokeilu Toisessa tutkimuksessa 12 europpalaista laboratoriota analysoi luonnollisesti kontaminoituneita ohranäytteitä sekä vehnälese- ja ruisnäytteitä, joihin oli lisätty OTA:a. OTA:n pitoisuudet vaihtelivat välillä 3 ja 9 ng/g. Keskimääräiset OTA:n saannot vaihtelivat 64%:sta 72%:iin. Laboratorioiden sisäiset suhteelliset keskihajonnat olivat 12-23% ja laboratorioiden väliset suhteelliset keskihajonnat 18-29%. Viite vertailuraporttiin: Journal of AOAC INTER- NATIONAL 79 (1996):5, 1102-1105. 7.2 Second interlaboratory study In a second study 12 European laboratories analysed samples of naturally contaminated barley and samples of wheat-bran and rye to which OTA had been added. The concentrations of OTA ranged from 3 to 9 ng/g. Mean recoveries of OTA ranged from 64 to 72%. Within-laboratory relative standard deviations were 12-23% and between-laboratory relative standard deviations were 18-29%. Reference to this second study report: Journal of AOAC INTERNATIONAL 79 (1996):5, 1102-1105. 8. MENETELMÄN ASIANTUNTIJAT Tämä menetelmä perustuu Official Methods of Analysis of AOAC INTERNATIONAL:in menetelmään no. 991.44. AOAC tutki menetelmää kollaboratiivisesti materiaaleilla, jotka sisälsivät OTA:a pitoisuuksissa yli 10 ng/g (katso 7.1). Myöhemmin, toisessa kollaboratiivisessa tutkimuksessa, (katso 7.2) menetelmää tutkittiin OTA-pitoisuustasoilla, jotka olivat alempia kuin AOAC-tutkimuksessa, 3-9 ng/g. Menetelmää on uusittu tämän toisen tutkimuksen tuloksien perusteella. Uusimistyö ja kokeiilun on suorittanut Kjell Larsson, Statens Lantbrukskemiska Laboratorium, Uppsala, Ruotsi (sittemmin työssä Lantmännen Foderutveckling AB:ssa Tukholmassa) yhteistyössä Tord Möller:in kanssa (Livsmedelsverket, Uppsala, Ruotsi). 8. REFEREES OF THE METHOD This method is based on method no. 991.44, Official Methods of Analysis of AOAC INTERNA- TIONAL. AOAC tested the method collaboratively on test materials containing OTA at levels higher than 10 ng/g (see 7.1). Later, in a second collaborative study (see 7.2) the method was tested on materials containing OTA at lower levels than those given in the AOAC method, 3-9 ng/g. The method was revised in accordance with the results of the study. The revision and study work was done by Kjell Larsson, National Laboratory for Agricultural Chemistry, Uppsala, Sweden (now working for Lantmännen Foderutveckling AB in Stockholm) in cooperation with Tord Möller, National Food Administration, Uppsala, Sweden. Nordic Committee on Food Analysis