Kalat koe-eläiminä Kalat Selkärankaisten suurin ryhmä, 25 000 30 000 lajia Teleosteiryhmässä. (Teleostei = varsinaiset luukalat). Käytetty mm. embryologisissa, neurobiologisissa ja ympäristötutkimuksissa (solu, yksilö ja populaatiotasolla) sekä genetiikan tutkimisessa (esim. geeninsiirtotutkimuksissa, geenien ilmenemistutkimuksissa ym.). Henri Koivula Biolääketieteenlaitos, HY Kalojen käyttö tutkimuksessa lisääntynyt vesiviljelyn kasvamisen sekä genetiikan tutkimuksen myötä. Kokeissa käytettävien lajien suuri määrä asettaa haasteita yhtenäisen hoitoohjeistuksen luomiseksi. Lohikalat, kalanviljely Kultakala, neurotieteet Kolmi-ja kymmenpiikki, evoluutiobiologia Seeprakala, kehitysbiologia Nahkiainen, neurotieteet EU on laatimassa lajikohtaisia ohjeita yleisimmin käytetyille kaloille. 1
1600 Tieteellisten julkaisujen lukumäärä hakusanalla "zebrafish" Number of publications per year in pubmed 1400 1200 1000 800 600 400 200 0 1980 1981 1982 1983 1984 1985 1986 1987 1988 1989 1990 1991 1992 1993 1994 1995 1996 1997 1998 1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 http://eur-le.europa.eu/leuriserv/leuriserv.do?uri=com:2010:0511:rev1:fi:pdf??? STREISINGER George Streisinger aloitti tutkimukset seeprakalalla 1970-luvulla. Streisinger halusilöytää selkärankaisen tutkimusmallin jota olisi helppo ylläpitää. Miksi seeprakala??? Vuonna 1981 Nature julkaisi Streisingerin artikkelin seeprakalan kloonaamisesta. Kyseinen artikkeli sai paljon huomiota ja kiinnostus seeprakalaakohtaan kasvoi. Saksassa tehty laaja mutaatioseulonta 90 luvulla oli myösmerkittävä, sillä siinä todettiin että seeprakalaa voitaisiin käyttäämallinaihmisten tautien tutkimisessa. 2
ETUJA Helppo ja halpa ylläpitää Naaraan ulkopuolella tapahtuva hedelmöitys ja alkion kehitys Läpinäkyvät alkiot Nopea sukukypsyys Helppo manipuloida geneettisesti Useita kalalinjoja saatavilla, transgeenisia ja mutantteja. Selkärankainen malli HAASTEITA Genomia ei ole täysin vielä täysin sekvensoitu Seeprakalojen kudetus http://www.youtube.com/watch?v=a12lkwix3jq&feature=relat ed Mätimunan kehitys http://www.youtube.com/watch?v=mloemwhanxc&feature=related Seeprakalan kehitys Adult 3-4 months Fertilization Freely swimming larvae 5d Pharyngula period 29h Hatching 48h http://biology.caltech.edu/members/prober 3
Kalojen kasvatusympäristö Veden laatu on tärkein kalojen hyvinvointia ylläpitävä sekä stressiä ja tautiriskiä vähentävä tekijä. Veden kierrättämisen kiertovirtausjärjestelmien kautta tai veden suodattamisen altaissa tulisi olla riittävää, jotta veden laatua koskevat parametrit pysyvät hyväksyttävällä tasolla. Käytössä olisi oltava seurantajärjestelmä, jolla varmistetaan, että kaloilla on riittävä määrä hyvälaatuista vettä. 4
Altaiden oltava sopivan kokoisia vaadittavalle kalatiheydelle ja veden virtaamalle. Kalojen käyttäytyminen vaikuttaa kalatiheyteen; parvija reviirikäyttäytyminen huomioitava Altaille pääsyn tulisi olla valvottua ja siten järjestettyä että kaloja häiritään mahdollisimman vähän 11 Yleiset vaatimukset MMM ASETUS nro 36/EEO/2006 Koe-eläimen pitopaikan ja välineiden materiaalien ja rakenteiden on oltava helposti puhtaana pidettäviä, tarvittaessa desinfioitavissa tai steriloitavissa, eivätkä ne saa vaarantaa eläimen hyvinvointia. 12 Erityiset vaatimukset:... Pitopaikan veden happipitoisuuden, laadun, vaihtumistiheyden ja virtausnopeuden on oltava kaloilla ja muilla vesieläimillä niille sopivat. Jos eläimen terveys tai hyvinvointi voi vakavasti vaarantua koneellisen ilman- tai vedenvaihtojärjestelmän toimintahäiriön vuoksi, järjestelmässä on oltava hälytys toimintahäiriön varalta. Pitopaikassa on oltava mahdollisuus riittävän ilman- ja vedenvaihdon järjestämiseen myös koneellisen järjestelmän häiriöiden aikana. 5
Happi Typpiyhdisteet ph Suolapitoisuus Lämpötila Valaistus Virtaama Melu Seurattavat parametrit: Seeprakalan vedenlaatuvaatimukset lämpötila 26-30 Happi (mg/l) > 6 ph 6-8 Sähkönjohtokyky (µs) 450-1000 Ammonium TAN (mg/l) < 1,0 Nitriitti (mg/l) < 0,005 Nitraatti (mg/l) < 200 kovuus mg/l CaCl3) 100-300 Alkaliniteetti (mg/l) 50-300 Hiilidioksidi (mg/l) < 20 valosykli 14 / 10 h Lähde: www.zbrafish.net.bio.net Kalojen ylläpitoon liittyvät rutiinit: Päivittäinen ruokinta Kirjanpito ja terveyden seuranta Vedenlaadun tarkkailu ja seuranta Erilaisten kantojen ylläpito Poikasten kasvatus ja tuottaminen Kalojen terveys Useimmat taudit liittyvät stressiin: - huonot olosuhteet, liiallinen käsittely tms. Hygieniasta huolehdittava: - altaiden puhdistus ja haavien desinfiointi - vältettävä kontaminaatioita eri altaiden välillä Kalojen terveysongelmista ja kuolleisuudesta pidettävä luetteloa. Laitokseen ulkopuolelta saapuvat kalat asetettava karanteeniin 6
Kalataudit Tautien välttäminen 1. BAKTEERITAUTEJA mm: Evämätä Vibrioosi Kalatuberkuloosi Kidustulehdus Paisetauti 2. VIRUSTAUTEJA mm: Syylätauti Lymfokystis-virustauti Verenvuotoreptikemia(VHS) Haimakuoliotauti (IPN) 3. SIENITAUTEJA mm: Vesihome Kidusrutto 4. LOISET mm: Haukimato Leveä heisimato Kalajuotikas Kalatäi Siian rakkoloinen Kuolleet kalat tulisi poistaa välittömästi altaasta. Sairastuneet kalat siirrettävä erilliseen altaaseen hoitoa varten. Uudet kalat pidettävä karanteenissa. Stressiä ja turhaa käsittelyä vältettävä. Yliruokintaa vältettävä. Kaikki välineet jotka olleet kosketuksissa sairaiden kalojen kanssa tulisi desinfioida huolellisesti. Käytä käsineitä kun käsittelet kaloja. Jos kalojen hoitoon käytetään antibiootteja, on antibiootin joutumista laitoksen vesikiertoon ehdottomasti vältettävä. -> tuhoaa filtterit. Kalojen käsittely Käsittelyn oltava minimaalista stressin välttämiseksi Toimenpiteiden ajaksi kalat tulisi nukuttaa erillisessä astiassa Kaloja pyydystettäessä tulisi käyttää oikeankokoisia, desinfioituja haaveja Kun kala on nostettu vedestä, sitä tulisi käsitellä kostein käsin tai hanskoin suomu- ja limakalvovaurioiden estämiseksi KALOJEN KULJETUS Kuljetukset suunnitellaan huolellisesti etukäteen. Kuljetuksen aikaista hapenkulutusta voidaan vähentää kaloja paastottamalla. Huom, tarkista lajikohtaiset suositukset paaston pituudesta. Suuremmat kalat vaativat suuremmat kuljetusaltaat. Esim. Lohikaloja kuljetetaan yleensä 2000-4000 l altaissa. Näissä on oltava erilliset hapettimet ja veden laatua on tarkkailtava koko kuljetuksen ajan. 7
Ennen siirtoa, lämpötilaerot tasataan ja kaloja totutellaan uuden kotipaikan oloihin sekoittamalla kohteen vettä kuljetusveteen. nk. akklimaatio SEEPRAKALOJEN KULJETUS Aikuiset seeprakalat Kaksinkertaisestamuovisukasta tehdään nk. happipakkaus johon laitetaan kaloja 10 kpl/1,9 litraa vettä. 2/3 happipakkauksen tilavuudesta täytetään paineilmalla tai hapella. Ennen kuljetusta kalat pistetään yhden päivän paastolle. Kuljetusvesi pysyy näin paremman laatuisena. Seeprakalan poikaset Mätimunat voidaan kuljettaa 250-500 ml muovipulloissa, tai isommissa falcon tubeissa. Kuljetustiheys n. 1-2 kpl / ml E3 Metyleeni sinistä (0.5mg/l tai 0.5 ppm) voidaan lisätä kuljetusveteen estämään sienitartuntoja. ANESTESIA Nukutusta tarvitaan kalan käsittelystä johtuvan kivunja stressinvälttämiseksi. Kemialliset nukutusaineet yleisimmät: Trikaiini (MS-222) ja Bentsokaiini. Seeprakalat ja muut pienemmät kalat voidaan nukuttaakylvettämällä nukutusliuoksessa, suurempiin kaloihin nukutusainevoidaan myös injisoida. Nukutuksen jälkeen kalat laitetaan virkoamaan erilliseen, ilmastettuun altaaseen. Palautus omiin altaisiinsa vasta kun kalat ovat täysin palautuneet nukutuksesta. Nukutusaineentehokkuuteen vaikuttaa mm: Veden lämpötila, ph, suolaisuus, ja happisaturaatio Kalan koko, ikä, laji, ja terveyden tila. Anestesian vaihe Kuvaileva nimi Vaiheen tuntomerkit kalassa 0 normaali reagoi ulkoisiin ärsykkeisiin, hengitystiheys ja lihasjännitys normaali 1 lievä rauhoittuminen 2 syvä rauhoittuminen 3 osittainen tasapainon menetys 4 täydellinen tasapainon menetys 5 refleksitoiminta lakkaa 6 hermotoiminta lakkaa reagoi hieman heikommin näkö- ja kuuloarsykkeisiin, hengitystiheys hieman pienempi, tasapaino normaali ulkoisista ärsykkeistä reagoi ainoastaan korkeaan paineeseen, hengitystiheys hieman pienempi, tasapaino normaali lihasjännitys hieman alhaisempi, uinti säännötöntä, hengitystiheys hieman suurempi, reagoi vain voimakkaaseen kosketus- tai tärähdysärsykkeeseen täydellinen tasapainon ja lihasjännityksen menetys, hidas mutta säännöllinen hengitystiheys, selkäydinrefleksit katoavat ei reagoi mihinkään, hengitystiheys hidas ja epäsäännöllinen, sydämen syke hyvin matala, ei refleksitoimintaa hengitysliikkeet loppuvat, sydämen syke lakkaa yleensä pian (Summerfelt & Smith, 1990). 8
Verinäytteen ottaminen Nukutus ennen näytteen ottoa. Kalalla verta vähän ja se hyytyy nopeasti. Näytteenottotavat: Sydänpunktiolla suoraan sydämestä Laskimolaajennuksesta tai Cuvierin viemäristä Pyrstövaltimosta tai laskimosta Katkaistusta pyrstöstä (pieniltä kaloilta) Kanyloimalla esim. dorsaaliaortasta DC = cuvierin viemäri SV= laskimolaajennus A = eteinen V = kammio B = valtimokeko Kantojen ylläpito ja seuranta * Tarvittaessa yksittäiset kalat voidaan merkata esim. eväleikkauksilla, polttomerkillä ja värikäsittelyllä * Laitoksessa olevista ja sinne saapuvista ja lähtevistä kaloista tulisi pitää ajan tasalla olevaa kirjanpitoa Yksilömerkintä: Kalojen merkintä: Koe-eläinten lopetusmenetelmät, MMM Asetus nro 36/EEO/2006 mukaan Kalat Carlin-merkki T-ankkurimerkki/ nuolimerkki Kylmäpoltto / polttomerkki Eväleikkaus Mikrosiru / kuonomerkki Ryhmämerkintä: Värimerkintä Kudosvärjäys Fysikaaliset menetelmät sallittu huom: voimakas isku päähän kuolema varmistettava muulla menetelmällä niskamurto ja välitön aivojen tuhoaminen alle 300g painoiset kalat aivojen tuhoaminen anestesiassa dekapitaatio dekapitaatio ja välitön aivojen tuhoaminen verenlasku anestesiassa, tainnutuksen jälkeen aivoihin tunkeutuva mekaaninen laite ampuminen ilmaembolia mikroaallot sähkötainnutus maseraatio (teholeikkurisekoitinlopetus) alle 2 cm:n pituiset kalat sähkötainnutus ja välitön aivojen tuhoaminen nopea jäähdytys nopea syväjäädytys 9
Koe-eläinten lopetusmenetelmät, MMM Asetus nro 36/EEO/2006 mukaan Nestemäiset ja liuoksessa annettavat lopetusaineet sallittu Huom: MS-222 bentsokaiini etomidaatti metomidaatti 2-metyyli-kinoliini pentobarbitaali vatsaonteloon T-61 KCl sekobarbitaali/dibukaiini etanoli 2-metyylikinoliini /nuperkaiini kloraalihydraatti Kaasumaiset lopetusaineet halotaani enfluraani isofluraani hiilidioksidi 10