Luento 1 Torstai Suvi Häkkinen

Transkriptio

1 Luento 1 Torstai Suvi Häkkinen

2 Kasveista saatavat lääkeaineet

3 Bioteknologian aikajana 6000 EKR 4000 EKR 500 EKR 100 EKR oluthiiva Hiivaleipä, jugurtti, juusto, etikka, viini 1.antibiootti: homeinen soijapapumaito 1. hyönteismyrkky: krysanteemijauhe mikroskooppi solu 1. Bakteeri tunnistetaan isorokkorokote Proteiinit löydetään evoluutioteoria Ensimmäiset geenikartat Röntgensäteet ja mutaatiot penisilliini DNA sisältää geneettisen informaation DNAn rakenne Geneettinen koodi 1.DNAn sekvennointimenetelmä PCR 1.Bioteknisesti tuotettu rokote (B-hepatiitti) 1.Bakteerin perimä Hiivan perimä 1.Kloonattu eläin 1.Kasvin perimä 1.Versio ihmisen geenikartasta

4 Biotekniikka Biotekniikalla tarkoitetaan eliöiden elintoimintojen, elävien solujen tai niiden osien käyttämistä hyväksi tuotteiden valmistamisessa. Biotekniikka ei ole sama kuin geenitekniikka

5 Biotekninen tuotto Tuottoisännät Bakteerit (E. coli) Hiivat (Saccharomyces cerevisae) Homeet Eläinsolut / eläimet (CHO=Chinese Hamster Ovary, VERO = African Green Monkey Kidney) Kasvisolut / kasvit

6 Moderni biotekniikka Ensimmäiset biotekniikalla valmistetut lääkkeet olivat: rdna insuliini vuonna 1982 Kasvuhormoni EPO (erytropoietiini)

7 WHO:n arvion mukaan noin 80 % maailman väestöstä käyttää kasviperäisiä lääkkeitä ensisijaisena hoitona Suurin osa lääkekasveista ei ole viljeltyjä vaan kerätään luonnosta => uhka kasvilajien häviämiselle Arviolta kasvilajia käytössä lääketarkoituksiin, näistä 2/3 kasvaa luonnossa Euroopassa vain 10 % lääkekasveista viljeltyjä Tarvitaan vaihtoehtoisia ja ympäristöä säästäviä tuotantosysteemeitä!

8 Lääkekasveista numeroina Vuosina yhteensä 1184 uutta molekyyliä hyväksyttiin lääkkeiksi Näistä 52 % on luonnonaineperäisiä ja 30 % täysin synteettisiä Kaikista tähän mennessä myönnetyistä anti-inflammatorisista lääkkeistä 52 % ja antikarsinogeenisistä lääkeistä 51 % on suoraan tai epäsuorasti luonnosta peräisin Viimeisten 35 vuoden aikana markkinoille saatettiin yhteensä 24 täysin uutta luonnonainetta, joista 79 % on peräisin mikrobeista ja 21 % kasveista Kasviperäisten lääkeaineiden merkitys erityisen suuri taistelussa syöpää vastaan Camptothecin (Camptotheca acuminata)

9 Kasvien merkitys lääkeaineiden lähteinä 1. Suurin osa olemassaolevista lääkeaineluokista joko sisältävät luonnonaineen tai ovat luonnonaineista peräisin olevia johdoksia

10 Luonnonaineperäisiä lääkkeitä jotka ovat olleet markkinoilla ennen synteettistä lääkettä Tulp & Bohlin, 2002

11 Kasvien merkitys lääkeaineiden lähteinä 1. Suurin osa olemassaolevista lääkeaineluokista joko sisältävät luonnonaineen tai ovat luonnonaineista peräisin olevia johdoksia 2. Suurimmalle osalle alun perin synteettisistä lääkkeistä on myöhemmin löydetty samalla tavoin toimiva luonnonainevastine

12 Synteettisiä lääkkeitä, joille myöhemmin on löydetty toiminnaltaan vastaava luonnonainevastine Tulp & Bohlin, 2002

13 Kasvien merkitys lääkeaineiden lähteinä 1. Suurin osa olemassaolevista lääkeaineluokista joko sisältävät luonnonaineen tai ovat luonnonaineista peräisin olevia johdoksia 2. Suurimmalle osalle alun perin synteettisistä lääkkeistä on myöhemmin löydetty samalla tavoin toimiva luonnonainevastine 3. Tunnetaan useita kohteita, joille on olemassa luonnonainesubstraatti, mutta joille ei vielä ole olemassa lääkettä

14 Targetteja, joille on löydetty luonnonaine Tulp & Bohlin, 2002

15 Kasvien bioaktiiviset yhdisteet Primaarimetaboliitit Hiilihydraatit Proteiinit, entsyymit - bioaktiiviset proteiinit ja peptidit Rasvat Sekundaarimetaboliitit flavorit tuoksut värit pestisidit hienokemikaalit lääkeaineet Uudet tuotteet

16 Kasvien sisältämät yhdisteet Maailmassa arvioidaan olevan noin kasvilajia Kemiallisesti tutkittuja vain noin 10 % Kasvien syntetisoimia pienimolekyylisiä yhdisteitä tunnetaan yli Vuosikymmenien aikana löydetty paljon kallisarvoisia lääkeaineita, jotka ovat edelleen lääketeollisuuden käytössä Esimerkiksi: morfiini, kodeiini, atropiini, skopolamiini, paklitakseli

17 Kasvit ovat tärkeitä lääkeaineiden lähteitä Morphinan alkaloids Analgesic Sesquiterpene lactone Antimalarial Lignan Antineoplastic Quinoline alkaloid Antimalarial Diterpene Antineoplastic Steroidal glycoside Cardiovascular

18 Catharanthus roseus (punatalvio) N OH CH 3 N H CH 3 O O CH 3 O N H CH 3 Vinkristiini O N H H HO O O H OCH 3 O CH 3 Käyttö: Hodgkinin tauti, akuutti leukemia, rintasyöpä Pitoisuus kasvissa: Lehdissä n % (tarvitaan n. 500 kg kasvimateriaalia, jotta saadaan 1 g vinkristiiniä) Maailman markkinat vuodessa: ~ 1000 milj. dollaria Hinta: ~ /g

19 Podophyllum- ja Linum-lajit O H OH H O Podofyllotoksiini O H H O CH 3 O OCH 3 OCH 3 - podofyllotoksiinista valmistetaan puolisynteettisiä johdannaisia: Etoposidi, Etophos ja Teniposidi Käyttö: akuutti lymfaattinen leukemia, pienisoluinen keuhkosyöpä, kivessyöpä ja lasten aivokasvaimet Pitoisuus kasvissa: n % Maailman markkinat vuodessa: ~ 400 milj. dollaria Hinta: 1400 / g

20 Dioscorea-lajit (mm. jamssi) H CH 3 O H CH 3 CH 3 CH 3 H H H H O H HO H Diosgeniini Käyttö: hormonilääkkeiden valmistamiseen Tarve: ~ 2100 tonnia diosgeniinia vuodessa Pitoisuus kasvissa: 4 vuotta vanhan kasvin juuressa n. 5%

21 Kasvien tärkeys lääkemolekyylien tuottajina Noin neljännes kaikista länsimaissa olevista lääkkeistä sisältää yhden tai useamman vaikuttavan yhdisteen, joka on peräisin luonnosta Oikea kolmiulotteinen rakenne, hankala syntetisoida kemiallisesti Usein vaikea löytää hyvää synteettistä korvaavaa yhdistettä, jolla sama aktiivisuus, spesifisyys ja lääkkeellinen vaikutus Kasveista mahdollista löytää uusia lääkemolekyylejä

22 Taxus brevifolia Marjakuusi Paklitakseli Syöpälääke 2.5 kg:n paklitakselisaanto vaatisi tonnia Taxus brevifolian kuorta ja yhteensä puun kaatamista nykyään paklitakseli tuotetaan kasvisoluviljelmien avulla

23 Kasvien merkitys uusien lääkemolekyylien lähteenä tänään Jo markkinoilla olevien lääkkeiden, jotka sisältävät kasveista peräisin olevia yhdisteitä, arvo on suuri Esimerkiksi yksinomaan USA:ssa se on yli 30 miljardia dollaria Uusia lääkemolekyylejä keksittiin vuosina runsas tuhat Näistä neljään merkittävimpään terapiaryhmään kuului lähes kolmannes, joista noin puolet oli saatu luonnosta Kasvien osuus uusien molekyylien lähteenä on siis edelleen erittäin merkittävä $ $

24 Kasvien merkitys uusien lääkemolekyylien lähteenä N ND NS B S Yhteensä N+ND+NS (%) Mikrobilääkkeet Bakteerilääkkeet Sienilääkkeet Viruslääkkeet Syöpälääkkeet Verenpainelääkkeet Tulehduslääkkeet Yhteensä N = luonnosta peräisin, ND = alkuperäinen molekyyli luonnosta, josta tehty puolisynteettinen johdos, NS = perusranka luonnosta, B = luonnosta peräisin, usein suuri proteiini, S = synteettinen yhdiste

25 Viimeisimmät uudet lääkeaineet Vuosina , 23 uutta lääkettä lanseerattiin markkinoille Uusien lääkeaineiden lkm ( ) maanpäälliset kasvit maaperän mikroorganismit merenelävät selkärankaiset ja selkärangattomat

26 Viimeisimmät kasviperäiset uudet lääkeaineet Vuosina , 23 uutta lääkettä lanseerattiin markkinoille Näistä 5 oli kasviperäistä: (1) Morfiiniderivaatta (Parkinsonin tauti) (2) Atropiiniderivaatta (keuhkoahtaudet) (3) Leptospermoniderivaatta (perinnöllinen tyrosinemia) (4) Selektiivinen asetyylikoliiniesteraasiinhibiittori (Alzheimerin tauti) (5) Artemisiniiniderivaatta (malaria)

27 Sekundäärimetabolia Kasvit syntetisoivat sekundäärimetaboliitteja tyypillisesti mm. puolustautuessaan (esim. patogeenit, kasvituholaiset, uv-säteily), pölyttäjien houkuttelu Usein suku- tai lajikohtaisia yhdisteitä Sekundäärimetaboliitit säilötään tyypillisesti solun sisälle, vakuoliin Tuotetaan hyvin pieniä määriä ja usein erityisissä solun- tai kasvinosissa ja tietyssä kehitysvaiheessa

28 Sekundaarimetaboliitit Alkaloidit indoli-, tropaani-, isokinoliinialkaloidit jne. Fenoliset yhdisteet fenyylipropanoidit, antosyaanit, kumariinit, flavonoidit, lignaanit, fenolihapot jne. Terpenoidit fytosterolit, karotenoidit, kardenolidit jne.

29 Sekundaarimetaboliitteja saadaan Luonnovaraiset tai viljellyt kasvit Kemiallinen synteesi Biotekninen tuotto (kasvisolut)

30 Kemiallinen synteesi Kasviperäisiä yhdisteitä voidaan syntetisoida kemiallisesti, jos niiden kiraalisuus tai sterokemia ei aseta ongelmia Kuitenkin kasvien sekundäärimetaboliitit ovat rakenteeltaan usein niin kompleksisia, että kemiallinen synteesi ei ole taloudellisesti kannattavaa Usein synteettisillä yhdisteillä ei ole samaa tehoa tai spesifisyyttä kuin luonnosta eristetyillä Useat luonnonaineet toimivat perusrunkoina synteettisille derivaatoille Esim. irinotekaani (syöpälääke), galantamiini (Alzheimerin tauti, alun perin eristetty lumikellosta, ei riittävästi kasvimateriaalia) Galanthamine

31 Production of medicinal compounds by plant cell cultures and whole plants (Häkkinen & Ritala, submitted).

32 Kasvisoluviljelmät vs kokonaiset kasvit Soluviljelmät: + Kontrolloidut & suljetut olosuhteet + Tuoton optimointi + Kasviuutteilla usein iso variaatio yhdisteiden määrissä ja spektrissä (mm. kasvupaikka/kasvuvaihe vaikuttaa) + Monet arvokkaat yhdisteet akkumuloituvat maanpäällisiin osiin, joissa myös paljon analytiikkaa häiritseviä/vaikeuttavia komponentteja (esim. polyfenolit, pigmentit) Erilaistumattomissa viljelmissä saannot usein pieniä (sekundäärimetabolian ja erilaistumisen korrelaatio) (esim. vinkristiini/vinblastiini ei tuoteta soluviljelmissä) Tuotto epästabiilia + Karvajuuriviljelmät (kts. myöh. hyvä tuotto, stabiilimpia kuin solususpensiot)

33 Kasvibiotekninen tuotanto Lähtökasvi Soluviljelmien aloitus Sopivien solulinjojen valinta Sekundaarimetaboliittituotannon käynnistäminen Tuoton optimointi Tuottomittakaavan nosto Yhdisteen eristäminen ja puhdistus Geenimuokkaus

34 Kasvibiotekniikan käyttösovellukset 1. Perustutkimus Solubiologia Kasvifysiologia ja biokemia Genetiikka Biosynteesireitit Entsyymien toiminta Fysiikka Mikrobiologia Soluviljelmät Biologia Biokemia Molekyylibiologia Genetiikka Kemia Luonnonainekemia Fysikaalinen kemia Entsyymitekniikka 2. Soveltava tutkimus Maatalous Elintarviketeollisuus Lääke- ja kemianteollisuus Biotekniikka Scale-up Tekniikka Jälkikäsittely Fermentoritekniikka Säätötekniikka

35 Perinteinen käyttö SIEMENET KEMIKAALIT, ENTSYYMIT KASVI MIKROLISÄYS KASVIBIOTEKNIIKKA KASVIEN MONISTAMINEN KALLUS BIOTEKNINEN KASVINJALOSTUS SUSPENSIO PROTOPLASTIT GEENINSIIRTO- TEKNIIKAT KEINOTEKOISTEN SIEMENTEN TUOTTO FERMENTORI KEMIKAALIEN JA ENTSYYMIEN TUOTTO

36 KASVIBIOTEKNIIKAN MÄÄRITELMIÄ Menetelmiä, joilla biologisia prosesseja voidaan kontrolloida Tuottonopeudet mahdollistavat taloudellisen tuoton Tekniikat, joilla viljellään in vitro kudosta, soluaggregaatteja ja yksittäisiä soluja synteettisellä alustalla kontrolloiduissa, steriileissä olosuhteissa

37 KASVISOLUN TOTIPOTENSSI Pintasteriloitu kasvin osa Kalluksen tuotto Kallusviljelmä kiinteällä alustalla suspensioviljelmä Entsyymikäsittely kasvi kallusklooni Kasvin regenerointi Soluseinän regenerointi Protoplasti

38 ETUJA 1. Aika 2. Muuttujien optimointi 3. Maantieteelliset edut 4. Vuodenaikojen vaihtelu 5. Kloonaustekniikat 6. Taloudellisuus 7. Mahdollisuus tuottaa uusia yhdisteitä

39 VAATIMUKSIA 1. SteriiIiys - tarvikkeet, alusta, työntekijät 2. Fysikaaliset olosuhteet - valo, lämpötila, ph, O 2, CO 2, kosteus 3. Alustan koostumus

40 STERIILIYS kasvisolut kasvavat hitaasti, alustan ravinnekomponentit usein optimaalisia myös mikrobeille infektioriski (bakteerit, sienet) alustan valmistus: varastoliuokset sokerin lisäys erikseen ph -säätö agarin lisäys sterilisointi autoklaavi 121 C (1 bar), min (ph muuttuu yks.) steriilisuodatus 0.2 m pullojen sulkeminen (folio) lasitavaran sterilointi (autoklaavi, lämpösterilointi 2-3h 160 C)

41 AUTOKLAVOINTI, haittoja 1. Vaikutus sokereihin 2. Vaikutukset kasvunsäätelijöihin 3. Vaikutus ph:een 4. Kemialliset reaktiot 5. Vaikutukset lämpöherkkiin komponentteihin STERIILISUODATUS, haittoja 1. Adsorptio suodattimeen 2. Monimutkaisempaa kuin autoklavointi 3. Viruspartikkelit pääsevät läpi 4. Vesiagar valmistettava erikseen 5. Kallis

42 ASEPTIIKKA Alkoholisterilointi (70 % etanoli) Laminaarivirtauskaappi Liekitys Kasvimateriaalin sterilointi sodium hypochlorite % calcium hypochlorite 9-10 % bromine water 1 % mercuric chloride % ethanol 70 % (ei riittävä sellaisenaan) silver nitrate 1% detergentin lisäys (e.g. Tween 20) käsittelyn jälkeen huolellinen pesu vedellä! 5-30 min 5-30 min 2-10 min 2-10 min min 5-30 min

43 Valo ikä, rytmi, intensiteetti FYSIKAALISET TEKIJÄT päiväpituus 16 h valo/8 h pimeä tai jatkuva valaistus tai jatkuva pimeä näkyvä valo nm valaistus mw cm -2, liian korkea teho vahingoittaa in vitro viljelmiä fluoresentti valo (cool white light) aallonpituus vaikuttaa organogeneesiin, hormoneihin (IAA) valo stimuloi esim. karotenoidien, flavonoidien ja polyfenolien biosynteesiä, mutta inhiboi esim. alkaloidituottoa tupakan soluviljelmissä ja shikoniinin tuottoa inaktivoimalla koentsyymiä, joka osallistuu hapetus-pelkistyssysteemiin biosynteesissä

44 FYSIKAALISET TEKIJÄT O 2 ilmastus tärkeää kasvisoluille, ovat aerobisia 6,8 l O 2 /g FW/ min ravistelu: rpm kasvisoluilla alhaisempi metabolinen aktiivisuus kuin mikrobeilla alhaisempi hapen tarve pullojen sulkeminen (esim. folio) ja petrimaljat (parafilm, huokoinen teippi) ilmastus ja ravistelu: vaikutukset etyleeniin, hiilidioksidiin & muihin haihtuviin yhdisteisiin CO 2 suljetuissa pulloissa konsentraatio suhteellisen korkea Kosteus korkea kosteus infektioriski

45 Lämpötila FYSIKAALISET TEKIJÄT yleensä vakio C, optimi C tai C (Rosa sp.) yleensä ei yli 32 C sokerien ja typen metabolia kiihtyy C alhaisempi lämpötila: kukkien silmujen muodostuminen, dormanssin rikkominen, siementen itäminen jne. joskus käytetään vaihtelevaa lämpötilaa (päivä yö) ph kasvulle sopiva alussa vaikuttamatta lopulliseen kasvuun liian alhainen ph IAA & gibberelliinihappo stabiilius heikkenee, agar veltostuu, jotkut suolat sakkaavat, vitamiinien stabiilius heikkenee, ammoniumin sisäänotto hidastuu autoklavoinnin vaikutus, alentaa yks. puskurointi puskuriliuosten avulla (MES, TRIS) ja itse solut puskuroivat! puskurikapasiteetti: kasvun aikana ph laskee (e.g )

46 ALUSTAN KOOSTUMUS (I) Epäorgaaniset suolat - makroelementit (e.g. Fe, K, N, Ca, Mg) - mikroelementit (e.g. Co, Cu, B, Mn, Zn, I, Mo) Hiilen lähde - yleensä sakkaroosi - muita: glukoosi, maltoosi jne. Kasvun säätelijät - auksiinit, sytokiniinit, gibberelliinit

47 ALUSTAN KOOSTUMUS (II) Vitamiinit Lisäaineet -aminohapot - sokerialkoholit - kookosvesi, hiivauute - prekursorit (Agar tai agaroosi)

48 ALUSTAN KOOSTUMUS (III) Veden lisäksi alustassa on hiilen ja typen lähteet, epäorgaanisia suoloja, vitamiineja ja kasvunsäätelijöitä Hiilihydraattien suhteen useimmat soluviljelmät ovat heterotrofisia myös valossa (l. tarvitsevat myös orgaanista hiiltä) Sakkaroosi ja glukoosi g/l vaikutukset etenkin primäärimetaboliaan Epäorgaaniset suolat makroelementit (e.g. Fe, K, N, Ca, Mg) mikroelementit (e.g. Co, Cu, B, Mn, Zn, I, Mo) tärkeää, että lisätään oikeissa suhteissa ja oikeassa muodossa nitraatit, sulfaatit, fosfaatit ja kloridit rauta kompleksina Mo, Co, Cu toksisia suurissa konsentraatioissa ionien molaariset suhteet tärkeitä typpi NO 3 /NH 4

49 ALUSTAN KOOSTUMUS (IV) Mikroelementit usein vaikea kontrolloida agar voi toimia mikroravinteiden lähteenä Vitamiinit toimivat katalyytteinä entsyymisysteemeissä B 1 välttämätön (tarvitaan etenkin kun vähän sytokiniineitä) nikotiinihappo, pyridoksiini foolihappo, riboflaviini, p-aminobentsoehappo (kun solutiheys pieni) vaikutus aggregaattien muodostumiseen myo-inositoli (alkoholi)

50 ALUSTAN KOOSTUMUS (V) Aminohapot orgaanisen hiilen lähde glysiini kaseiini hydrolysaatti (tarkkaa koostumusta ei tiedetä) l-glutamiini urea Vesi & Agar agar polysakkaridi absorboi vettä, alustan komponentteja korkea agar konsentraatio ravinnekomponenttien saanti heikkenee Difco Bacto agar % agaroosi puhdas, kallis ph:n vaikutus geeliytymiseen (alhainen ph geeliytyminen heikkenee) muita: biogel P 200, alginaatti, CCA, gelrite (gellangum), Cooke veden puhtaus: DW/Milli-Q

51 HORMONIVAATIMUKSET 1. Ei tarvita auksiinia eikä sytokiniiniä 2. Tarvitaan auksiinia 3. Tarvitaan sytokiniiniä 4. Tarvitaan sekä auksiinia että sytokiniiniä

52 KASVUNSÄÄTELIJÄT Auksiinit Sytokiniinit Gibberelliinit Etyleeni Abskisiinihappo

53 KASVUNSÄÄTELIJÄT Auksiinit IAA NAA 2,4-D Sytokiniinit Kinetin Zeatin Gibberelliinit GA 3 Etyleeni Abskisiinihappo ABA

54 HORMONIT Auksiinit 2,4-D (2,4-dichlorophenoxy acetic acid), NAA (naphthalene acetic acid), IBA (indole butyric acid), IAA (indole acetic acid), 2,4,5-T, CPA (pchlorophenoxy acetic acid) IAA luonnolinen auksiini, kasvisolut hajottavat entsymaattisesti, valoherkkä 2,4-D voi toimia sekä auksiinina että sytokiniinina, mutageenisiä ominaisuuksia, inhiboi fotosynteesiä indusoi solujakautumista indusoi kalluksen muodostumista (korkea auksiinipitoisuus) indusoi juuren muodostumista (alhainen auksiinipitoisuus)

55 Sytokiniinit HORMONIT kinetiini, zeatiini, BAP (6-bentsyyliaminopuriini, bentsyyliadeniini), 2-iP (isopentenyyliadeniini) zeatiini luonnollinen sytokiniini verson muodostuminen stimuloi kasvua ja erilaistumista edistää solujakautumista kun lisätään auksiinin kanssa Gibberelliinit GA 3 (gibberelliinihappo) indusoi varren pituuskasvua, meristeemien ja silmujen kasvua alkioiden ja siementen itäminen inhiboi organogeneesiä Abskisiinihappo Etyleeni embryogeneesin indusointi muodostuu kasvavissa soluissa, edistää vanhenemista

56 KASVISOLU n m uusia soluja muodostuu meristeemeissä muoto määräytyy solun toiminnan ja ympäristön mukaan soluorganellit (tuma, tumajyvänen, plastidit, mitokondrio) lisääntyvät jakaantumalla

57 SOLUORGANELLIT Tuma kaksikerroksisen membraanin ympäröimä (tumakotelo) tumalima kromosomit (DNA, proteiinit) tumajyvänen (RNA, proteiinit) Plastidit ei sinilevissä, bakteereissa tai sienissä kromatoforit ja leukoplastit (kromoplastit) (kloroplastit, feoplastit, rodoplastit) (amylopl., proteinopl., elaiopl.) fotosynt. inakt. fotosynt.akt. Sisältävät DNA:ta, proteiineja ja lipidejä

58 SOLUORGANELLIT Mitokondrio paljon siellä missä solujen toimita vilkasta ATP:n tuotto sisältävät RNA:ta ja DNA:ta tärkeä rooli solun kemiallisen energian siirrossa Golgin laite(diktyosomi) polysakkaridien synteesi, soluseinän muodostuminen ER (endoplastinen retikulumi) Vakuolit varastoivat esim. sekundaarimetaboliitteja Plasmodesmit solujenvälinen kommunikointi