Löydetty uusi proteiini, jolla haitallinen suubakteeri sitoo ihmisen puolustusjärjestelmän keskeisiä viestimolekyylejä

Transkriptio

1 Löydetty uusi proteiini, jolla haitallinen suubakteeri sitoo ihmisen puolustusjärjestelmän keskeisiä viestimolekyylejä Tuuli Ahlstrand Ohjaajat: FM Annamari Paino ja dos. Riikka Ihalin BIOKEMIA Erikoistyössä on tunnistettu bakteerin solukalvoproteiini, jonka avulla Aggregatibacter actinomycetemcomitans (Aa)-bakteeri sitoo ihmisen keskeistä tulehduksenvälittäjäainetta interleukiini (IL)-1β:aa. Aa bakteeri osallistuu hampaiden kiinnityskudosten tulehduksen eli parodontiitin syntyyn, joka hoitamattomana tuhoaa kiinnityskudoksia. Aa-bakteeri muodostaa muiden suussa olevien bakteerien kanssa yhdyskuntia eli biofilmiejä, jotka pystyvät tehokkaasti suojautumaan ihmisen puolustusjärjestelmältä, sekä myös häiritsemään puolustusta. Yksi vastikään tunnistamistamme häirintäkeinoista on Aa-bakteerin kyky sitoa itseensä tulehduksenvälittäjäainetta IL-1 :aa. IL-1 on keskeinen tulehdusta aikaansaava välittäjäaine ihmisen puolustussoluissa ja sillä on tärkeä rooli elimistön puolustureaktiossa bakteereita vastaan. Työn tavoitteena oli tutkia IL-1β:aa sitovan proteiinin sijaintia bakteerisoluissa sekä sen sitoutumista tulehduksenvälittäjäaineisiin. Proteiinin sijantia tutkittiin Aa-soluissa sekä Escherichia coli soluissa, jotka saatiin ilmentämään kyseistä proteiinia. Kalvoproteiinin havaittiin tuottuvan ainakin E. colissa bakteerin ulkokalvolle, mutta Aa-bakteereissa proteiinin sijainti on vielä varmistamatta. Proteiinin sitoutumista IL- 1β:aan tutkittiin käyttäen edellä mainittuja kokonaisia E. coli bakteerisoluja sekä puhdistettua liukoista proteiinia, jolloin havaittiin että kalvoproteiini sitoi IL-1β:aa, mutta myös joitain muita tulehduksenvälittäjäaineita. Ihmissolujen tuottamaa tulehduksenvälittäjäainetta sitova ulkokalvon proteiini on suubakteereilla täysin uusi mekanismi, jota ei ole molekyylitasolla tunnistettu aikaisemmin. Tämän mekanismin molekyylitason yksityiskohtien tutkiminen toisi uutta tietoa bakteeri-isäntä vuorovaikutuksesta. Ihmisen puolustusjärjestelmän välittäjäaineen sitominen saattaisi mahdollisesti vaikuttaa Aa:n virulenssigeenien aktivaation ja viivyttää ihmisen puolustusreaktion alkamista. 1

2 Kinaasien toiminnan selvittäminen Parkinsonin taudissa Dani Flinkman Ohjaaja: FT Eleanor Coffey Biokemia Työssä tutkittiin Parkinsonin taudissa vaikuttavien LRRK2 ja PINK1 kinaasien mekanismeja Parkinsonin taudin synnyssä. Näiden kinaasien toimintaa selvitettiin käsittelemällä hermosolukasvatuksia Parkinsonin tautia aiheuttavalla hyönteismyrkyllä rotenonilla ja testaamalla työssä tutkittujen kinaasien toimintaa tutkimalla LRRK2:n aktiivisuuden vaikutusta solujen selviytymiseen ja kuvantamalla PINK1:n liikettä solun eri osiin käsittelyn seurauksena. Tutkimuksessa selvisi, että LRRK2:n aktiivisuuden estämisellä solut selvisivät paremmin rotenonikäsittelystä. Lisäksi PINK1:n sijainti soluissa muuttui pistemäiseksi käsittelyn aikana. Parkinsonin tauti on keskushermostoa rappeuttava tauti, joka aiheuttaa sairastuneilla monia liikkumiseen ja tiedostamiseen liittyviä oireita. Taudin syntyyn vaikuttavia geneettisiä tekijöitä on löydetty useita, joista useat vaikuttavat solun sisäisen viestiliikenteen kannalta keskeisiin proteiineihin kinaaseihin. LRRK2:n ja PINK1:n mutaatiot aiheuttavat perinnöllistä muotoa Parkinsonin taudista ja vaikka tästä syystä niihin kohdistuu paljon huomiota, näiden kinaasien toiminnan mekanismit fysiologiassa ja taudinsynnyssä ovat jääneet toistaiseksi lähes tuntemattomiksi. Työssä saatuja tuloksia tutkitaan vielä lisää. Tavoitteena on määrittää tutkimuksen kinaasien tarkat tehtävät Parkinsonin taudin synnyssä. Tämä voi mahdollistaa uusien diagnostisien merkkien löytämisen tai uusien lääkkeiden kehityksen. 2

3 Ihmisen kehitysvammaisuutta aiheuttavaa proteiinia saatiin puhdistettua rakennetutkimuksia varten Emma Kuivalainen Ohjaajat: FT Elina Kuokkanen, FT Heidi Tuominen ja FT dos. Pirkko Heikinheimo BIOKEMIA Erikoistyössä puhdistettiin ihmisen CLN5-proteiinia (engl. Ceroid-lipofuscinosis, Neuronal 5), jonka tiedetään aiheuttavan vakavaa perinnöllistä kehitysvammaisuutta. Proteiinia tuotettiin bakuloviruksen avulla hyönteissoluissa, ja sitä puhdistettiin sekä hyönteissoluista että kasvatusliuoksesta. Samalla kehitettiin tapa seurata kuinka paljon CLN5-proteiinia saatiin talteen puhdistuksen välivaiheiden aikana. Puhdistusta tehostavat proteiiniin tehdyt muokkaukset toimivat hyvin, ja proteiinin eristys sekä soluista että kasvatusliuoksesta onnistui. Vaikka CLN5-proteiinin normaalia tehtävää soluissa ei tiedetä, tiedetään sen olevan lysosomin proteiini. Lysosomit ovat solun kierrätyskeskuksia, jotka pilkkovat vanhat ja toimimattomat solun rakenneosaset. Geenimutaation vuoksi muuttunut CLN5- proteiini ei enää toimi oikein, ja lysosomien toiminta häiriintyy. Tällöin mm. hermokudoksiin alkaa kerääntyä materiaaleja, jotka normaalisti olisi pilkottu lysosomeissa. Tämän seurauksena hermosto rappeutuu, johtaen kehitysvammaisuuteen. Proteiinin toiminnan selvittämistä voi auttaa sen kolmiulotteisen rakenteen ratkaisu, johon tarvitaan paljon puhdasta proteiinia. Rakenteen avulla voitaisiin saada lisää tietoa CLN5-proteiinin toiminnasta, ja siten mahdollisesti valaisevaa tietoa sairauden synnystä. 3

4 Valoa tuottavat bakteerit nopeuttavat ja helpottavat bakteereja tappavien aineiden tutkimusta Anu-Teija Kuovi Ohjaajat: FM Janne Atosuo ja dos. Esa-Matti Lilius BIOKEMIA Geenimuunnellut, tarkoilla mittalaitteilla havaittavaa valoa tuottavat bakteerit antavat yksinkertaisella mittauksella reaaliaikaista tietoa elävien bakteerien määrästä näytteessä. Tätä voidaan hyödyntää kaikenlaisten bakteereja tappavien aineiden, kuten antibioottien, ihmisen puolustusjärjestelmän osien tai kosteusvauriotaloista löytyneiden homemyrkkyjen tutkimisessa. Tutkimuksessa käytettiin Escherichia coli bakteeria, joka on hyvin yleisesti laboratoriotyössä käytetty nopeakasvuinen ja vaaraton suolistobakteerilaji. Näihin bakteereihin oli geeniteknisesti lisätty valontuottamisominaisuus eräästä syvänmeren bakteerista, siten että laboratoriokanta tuottaisi valoa jatkuvasti. Tutkimuksessa valoa tuottavia bakteereja kasvatettiin erilaisissa olosuhteissa sekä tapettiin eri aineilla. Bakteerien määrää seurattiin sekä valosignaalin perusteella että perinteisemmillä menetelmillä. Valomittaus antoi perinteisiä menetelmiä luotettavampaa tietoa elävien bakteerien määrästä monenlaisissa tapporeaktioissa, ja vaatii lisäksi huomattavasti vähemmän vaivaa kuin hidas ja työläs pesäkelaskentamenetelmä, joka on perustekniikka johon kaikkia muita tuloksia verrataan. Kasvatuskokeissa havaittiin kuitenkin, että olosuhteet, kuten kasvatusliuoksen ravinnepitoisuus ja ph vaikuttavat valontuoton määrään bakteeria kohti. Valon määrä ei siis suoraan kerro bakteerien määrää, mutta sen avulla voi havaita esim. kuinka suuri osa bakteereista on elossa. Tähän tarkoitukseen valoa tuottaviin bakteereihin perustuva määritys on nopea, helppo ja soveltuu niin suurten kuin hyvin pientenkin bakteerimäärien havaitsemiseen. 4

5 Vihreän rikkibakteerin kaksi erilaista solukalvoproteiinia Erika Nordbo Ohjaajat: FM Heidi Luoto, FT Anssi Malinen ja prof. Reijo Lahti BIOKEMIA Tutkimuksessa selvitettiin Chlorobium limicolan kahden solukalvoproteiinin toimintaa. Solukalvon pyrofosfataasi on entsyymi, joka pilkkoo pyrofosfaattia (PP i ) kahdeksi fosfaatiksi (P i ). Tästä reaktiosta vapautuvan energian avulla proteiini siirtää H + tai Na + -ioneja tai molempia solukalvon puolelta toiselle. Chlorobium limicola on vihreä rikkibakteeri, jolla on kaksi erilaista solukalvon pyrofosfataasia. Toinen kalvopyrofosfataaseista pumppaa Na + - ioneja ja toinen H + - ioneja. Proteiinien aminohappoihin tehtiin muutoksia, joiden avulla haluttiin saada selville, mitkä aminohapot määräävät kumpaa ionia proteiini siirtää. Aikaisemmin tutkimuksissa on todettu jo yhden kalvopyrofosfataasin auttavan kasveja ja bakteereja selviytymään esimerkiksi kuivuudesta. Tutkimuksen tavoitteena on vielä selvittää, miten nämä kaksi solukalvon pyrofosfataasia auttavat C. limicolaa selviytymään eri olosuhteissa. 5

6 Uusi RNA-merkkitekijä ihon okasolusyövässä Minna Piipponen Ohjaajat: Dosentti Liisa Nissinen ja professori Veli-Matti Kähäri BIOKEMIA Okasolusyöpä on yksi yleisimmistä syövistä maailmanlaajuisesti ja tapausten määrä kasvaa jatkuvasti. Ihon okasolusyövästä on löydetty uudenlainen merkkitekijä, joka on yhteydessä syövän kasvuun sekä syöpäsolujen liikkumiseen. Yleisistä syövän merkkitekijöistä poiketen tutkittava aine ei ole proteiini, vaan RNA-molekyyli, joka ei koodaa proteiinia. Tutkimuksessa havaittiin, että tämän RNA-molekyylin ilmentyminen oli koholla syöpäsoluissa ja kudoksessa terveeseen ihoon verrattuna. Lisäksi havaittiin, että tämän geenin hiljentäminen esti syöpäsolujen kasvua sekä liikkumista. Tämä viittaa siihen, että kyseinen RNA-molekyyli edistää ihon okasolusyövän kehittymistä, mutta sen tarkkaa toimintamekanismia ei vielä tunneta. Jatkossa olisi tärkeää selvittää, voiko tutkittavaa RNA-molekyyliä hyödyntää esimerkiksi okasolusyövän diagnostiikassa tai hoidossa. 6

7 The Role of the Chromatoid Body in Cytoplasmic RNA Regulation in Spermatids Karin Sõstar Supervisors: Assistant professor Noora Kotaja, Oliver Meikar MSc BIOCHEMISTRY More and more couples in the world face problems connected to having children. In half of the cases of infertility, the reasons are connected to male partner. The production of fertile spermatozoa in males is called spermatogenesis. It starts with the differentiation of stem cells into spermatocytes that go through two meiotic divisions and produce spermatids. The spermatids develop into spermatozoa that are capable of fertilizing an egg. The fertilized egg can give rise to a new organism. One structure that is found uniquely in spermatids is called the chromatoid body (CB). It is a structure that contains RNA molecules and proteins that are involved in RNA regulation. The function of different proteins in a cell can be studied using mouse models and it has been done for the proteins found in the CB. Mouse models that do not express components of the CB are infertile because spermatogenesis in these individuals is stopped in the round spermatid stage as a result no spermatozoa are produced. Thus it is important to study what makes the CB crucial for successful spermatogenesis. Our project aimed to improve our knowledge on how the CB is involved in RNA regulation in spermatids. We saw that RNAs can be localized in the CB for a long time this indicates that the CB might be a storage place for RNAs. In addition, recent mass-spectrometry analysis indicated that a lot of the proteins that are found in the CB are involved in RNA regulation. We confirmed the localization of some of the proteins in the CB with a more specific method. For example, a lot of RNAs produced in higher organisms, including humans, are spliced. Splicing means that some sequences are cut out of RNA sequences this process is needed before protein synthesis from those RNA molecules can occur. We found that spliced RNAs and protein components of the splicing machinery are found in the CB. Thus it is likely that the CB participates in regulating the spliced RNAs in the cell. More research has to be done on the CB to reveal its precise role in the spermatogenesis. We plan to continue describing the different types of RNAs found in the CB and to uncover the role of the CB in their regulation. 7

8 Ei-koodaavista RNA:ista uusi lääke ihosyöpään? Riitta Yrjönkoski Ohjaajat: Dosentti, FT Liisa Nissinen ja prof. Veli-Matti Kähäri BIOKEMIA Erikoistyössä havaittiin, että tutkittavien ei-koodaavien RNA:iden ilmentyminen oli korkeampaa ihosyöpiin kuuluvissa okasolusyövän soluissa sekä levyepiteelisyövän soluissa verrattuna ihon normaaleihin keratinosyytteihin. Jos okasolusyövän esiasteissa spesifiset ei-koodaavat RNA:t ovat eritavalla säädeltyjä, olisi mahdollista kehittää uusia markkereita sekä lääkkeitä, joilla pystyttäisiin tunnistamaan ja hoitamaan huonoennusteisia ihosyövän muotoja mahdollisimman varhain ja näin ehkäisemään invasiivisen syövän kehittyminen. Suomessa ihosyöpään sairastuvien ihmisten määrä on ollut pitkään kasvussa. Tähän on syynä mm. pitkään vallinnut ruskettumismuoti, sillä okasolusyövän esiintyminen liittyy usein kumulatiiviseen altistumiseen auringon ultraviolettisäteilylle. Lääkekehityksestä huolimatta levinneen okasolusyövän ennuste on kuitenkin edelleen heikko. Ei-koodaavia RNA:ita ei ole vielä tutkittu paljon, sillä aikaisemmin ihmisen perintöaineksen proteiinia koodamatonta ainesta pidettiin "roskana". Tähän mennessä on kuitenkin jo havaittu, että ei-koodaavien RNA:iden normaalista poikkeava säätely on osallisena useissa sairauksissa. Tämän takia ei-koodaavat RNA:t ovat mielenkiintoinen tutkimuskohde, niin uusien lääkkeiden kehittämisen kuin diagnostiikankin kannalta. 8

9 Tutut marjat koetaan miellyttävinä Tuija Niva Ohjaajat: FT Oskar Laaksonen ja ETT Antti Knaapila ELINTARVIKEKEMIA Ihmisen kokevat marjat eri tavalla. Tutkimuksemme mukaan miellyttävät marjat olivat kaikille miellyttäviä ja vähiten miellyttävät marjat olivat vain osalle miellyttäviä. Alustavissa Internet-kyselyn tuloksissa tutut marjat koettiin miellyttävimpinä ja niitä käytettiin enemmän. Mitä uutuudenpelkoisempi vastaaja oli, sitä vähemmän miellyttävinä ja vähemmän tuttuina hän koki tutkittavat marjat. Internet-kyselyssä tutkittiin marjojen miellyttävyyttä, tuttuutta ja käyttöä. Tutkittavat marjat olivat mustikka, mansikka, puolukka, vadelma, tyrni, marja-aronia, karpalo, mustaherukka, punaherukka, lakka, variksenmarja, pihlajanmarja, karhunvatukka ja karviaismarja. Internet-kyselyssä miellyttävin marja oli mustikka. Toiseksi miellyttävin marja oli vadelma ja kolmanneksi miellyttävin mansikka. Vähiten miellyttävin marja oli pihlajanmarja. Variksenmarja oli toiseksi ja marja-aronia kolmanneksi vähiten miellyttävä marja. Aistinvaraisessa arvioinnissa vastaajat arvioijat myös miellyttävyyttä, mutta sen lisäksi he saivat luokitella marjoja omien perusteluidensa mukaisesti. Tässä arvioinnissa oli mukana Internet-kyselyn yhdeksän ensin mainittua marjaa. Aistinvaraisen arvioinnin perusteella miellyttävin marja oli vadelma. Toiseksi miellyttävin marja oli mansikka ja kolmanneksi miellyttävin mustikka. Vähiten miellyttävin marja oli marja-aronia. Karpalo oli toiseksi ja tyrni kolmanneksi vähiten miellyttävä marja. Internet-kyselyyn vastasi 358 henkilöä. Heistä oli naisia 276 ja miehiä 82. Vastaajat olivat vuotiaita. Aistinvaraiseen arviointiin osallistui 88 arvioijaa. Heistä naisia oli 65 ja miehiä oli 23. Arvioijista 81,8 % oli vastannut myös Internet-kyselyyn. Tulosten käsittelyä jatketaan, erityisesti aistinvaraisen arvioinnin osalta. Alustavien tulosten mukaan tutut marjat koetaan miellyttävimpinä. Näin ollen niitä on helpompi käyttää. Tuntemattomammat marjat ovat haasteellisempia. Jos vähemmän tutut marjat tulisivat tutummiksi, niiden käyttö saattaisi lisääntyä. 9

10 Perunan makuun vaikuttavia yhdisteitä voidaan mitata suoraan perunasuikaleesta Heikki Aisala Ohjaajat: ETT Anu Hopia, FT Mari Sandell, FM Marika Kalpio ELINTARVIKEKEMIA Erikoistyössä kehitettiin menetelmä, jossa perunan makuun vaikuttavien yhdisteiden pitoisuuksia mitattiin perunan suikaleesta ilman tutkittavien yhdisteiden eristystä. Menetelmä perustuu mittaukseen, joka on perinteisesti ollut kemiallisten yhdisteiden rakenteen selvittämisen työkalu. Viime vuosikymmeninä menetelmää on kuitenkin käytetty enenevässä määrin yhdisteiden pitoisuuden määrityksessä. Eristäessä näytteen yhdisteitä haasteena on, että eristysvaiheen aikana voi muodostua uusia yhdisteitä, joita näytteessä ei ole luonnostaan. Lisäksi osa tutkittavista yhdisteistä jää laboratorioastioihin, ja näin ollen näytteen edustavuus heikkenee. Tässä tutkimusmenetelmässä perunan makuyhdisteet sokerit, aminohapot sekä orgaaniset hapot voitiin tunnistaa suoraan perunanäytteestä ilman erillistä eristystä, joten esikäsittelystä aiheutuvien muutosten oletettiin olevan pienempiä. Menetelmän havaittiin olevan herkkyydeltään ja erotuskyvyltään perunanäytteille haasteellinen, joten menetelmän rinnalla on hyvä olla täydentäviä analyysimenetelmiä. Toisaalta kerätyn aineiston laatu parani huomattavasti menetelmän kehityksen aikana, yltäen lähes uutettujen näytteiden tasolle. Kehitetyn menetelmän avulla voidaan tutkia monia kasviksia tai lähes mitä tahansa biologista, vesipitoista näytettä. Menetelmä soveltuu erityisesti tärkeiden makuaineiden muodostumisen ja vapautumisen seuraamiseen materiaalista esimerkiksi kypsennyksen edetessä. Kevään aikana tutkimusta jatketaan mittaamalla, miten perunan makuaineiden pitoisuudet muuttuvat keittämisen aikana. 10

11 Marjauutteiden antioksidanttitehon mittaaminen Anna Puganen Ohjaajat: FT Jukka-Pekka Suomela, prof. Baoru Yang, prof. Karen M. Schaich* ja prof. Heikki Kallio *Department of Food Science, Rutgers University ELINTARVIKEKEMIA Elintarviketeollisuudessa marjojen mehupuristuksen jälkeen saadaan paljon puristusjätettä sivutuotteena. Tässä työssä useiden marjojen puristusjätettä, kuten myös muutaman kuivatun marjan jauhetta, uutettiin neljä kertaa peräkkäin ja tutkittiin antioksidanttimenetelmien avulla. Suurempi antioksidanttikapasiteetti mitattiin ensimmäisessä uutteessa. Antioksidanttitehoa havaittiin myös toisessa ja kolmannessa uutteessa. Eräs marjoihin liittyvistä terveysväittämistä on juuri niiden antioksidatiivisuus. Marjat sisältävät runsaasti fenolisia yhdisteitä, jotka ovat biologisesti aktiivisia muun muassa hapettumisreaktioissa. Kasvukauden aikana fenolisia yhdisteitä kertyy erityisesti marjan lehtiin, kuoriin ja siemeniin. Mehun puristuksen jälkeen suuri määrä fenolisia yhdisteitä jää puristusjätteeseen. Tämän tutkimuksen tuloksilla saattaa olla hyödyllistä tietoa ja innostusta elintarviketeollisuuden tuotekehittäjille uusien sivutuotteita käytettävien sovellusten keksinnässä. Antioksidanttimenetelmät mittaavat yhdisteiden kykyä napata vapaita radikaaleja, joita syntyy hapettumisen aikana. Antioksidanttiaktiivisuuksia vertailemalla voidaan sanoa kuinka hyvä tietty yhdiste on sammuttamaan haitallisia hapetustuotteita ja tasapainottamaan hapetusreaktiota. On olemassa useita antioksidanttikapasiteetin mittausmenetelmiä. Menetelmät toimivat kuitenkin eri reaktiomekanismien avulla ja erilaisissa olosuhteissa. Tämän takia täytyy olla hyvin varovainen eri menetelmien avulla saatujen tutkimustulosten vertailussa. Antioksidanttiarvot ovat suuntaantavia, ne eivät välttämättä kerro marjan kaikista tehovaikutuksista. 11

12 Uuden vasta-aineen käyttö sydänkohtausmerkkiaineen tunnistajana Taina Heikkilä Ohjaajat: FM Heidi Hyytiä ja FT Eeva-Christine Brockmann MOLEKULAARINEN BIOTEKNIIKKA JA DIAGNOSTIIKKA Sydänkohtaus on maailmanlaajuisesti yksi yleisimmistä kuolinsyistä, jonka vuoksi sydänkohtauksen aikainen havaitseminen ja diagnosointi on tärkeää. Sydänkohtauksessa sepelvaltimon tukkeutuminen johtaa solujen hapenpuutteeseen ja sydämen paikalliseen solukuolemaan. Sydänkohtauksessa vaurioituneista soluista vapautuu verenkiertoon sydänperäisiä troponiineja I ja T (engl. cardiac troponin, ctn), joiden pitoisuuden nousua mitataan rintakipupotilaan verenkierrosta. Troponiini pystytään havaitsemaan jo pieninäkin pitoisuuksina, mikä mahdollistaa varhaisen diagnosoinnin. Näytteenä käytettävä veri kuitenkin sisältää paljon erilaisia häiritseviä tekijöitä, kuten troponiiniin sitoutuvia autovasta-aineita, jotka voivat aiheuttaa väärän negatiivisen tai positiviisen tuloksen. Erikoistyössä kehitettiin uudelle vasta-aineelle määritysmenetelmä sydänkohtauksen merkkiaineen, troponiini I:n (ctni), pitoisuuden mittaamiseen. Uudella vasta-aineella päällystettiin europiumleimaa sisältäviä pieniä noin 100 nm kokoisia partikkeleita. Määrityksessä mittauskaivon pohjaan kiinnitetyt kaksi troponiinin tunnistavaa vastaainetta sitoivat näytteessä olevan troponiinin. Leimaa sisältävään partikkeliin sidotun vasta-aineen avulla pystyttiin mittamaan näytteessä olevan ctni:n määrä. Uuden vasta-aineen avulla voidaan mahdollisesti kehittää määritysmenelmä, jolla havaitaan erittäin pieniä troponiinimääriä ja pystytään välttämään veren aiheuttamia häiriöitä mitattaessa ctni-arvoja potilasnäytteistä. 12

13 Bispesifiset sitojat haastavat perinteiset vasta-aineet diagnostiikassa Juuso Huhtala Ohjaajat: FM Heidi Hyytiä, FT Eeva-Christine Brockmann ja prof. Urpo Lamminmäki MOLEKULAARINEN BIOTEKNIIKKA JA DIAGNOSTIIKKA Diagnostisten määritysten herkkyyttä voidaan parantaa käyttämällä perinteisten leimattujen vasta-aineiden sijaan bispesifisiä sitojia. Ne sitoutuvat kohteeseensa vastaaineita voimakkaammin, joten määrityksellä pystytään havaitsemaan pienempiä pitoisuuksia kuin perinteisellä, vasta-aineisiin perustuvalla määrityksellä. Bispesifinen sitoja koostuu kahdesta tai useammasta yhteen liitetystä vasta-aineesta tai niiden osasta. Kun normaali vasta-aine tunnistaa vain yhden kohdan yhden molekyylin pinnasta, tunnistaa bispesifinen sitoja kaksi eri kohtaa. Tämä ominaisuus mahdollistaa bispesifisten sitojien käytön esimerkiksi syöpähoidoissa, mutta siitä on myös etua diagnostisissa sovelluksissa. Erikoistyössä tutkittiin mahdollisuuksia parantaa sydäninfarktin diagnostiikassa käytettyä troponiini-immunomääritystä käyttämällä perinteisten vasta-aineiden sijaan bispesifisiä sitojia. Määrityksen avulla mitataan potilaan veren troponiinipitoisuutta, joka nousee sydäninfarktin aikana ja sen jälkeen. Bispesifisiä sitojia valmistettiin liittämällä yhteen kaksi troponiinin tunnistavan vastaaineen osaa. Valmistettuja sitojia käytettiin troponiinimäärityksessä ja sen suorituskykyä verrattiin vastaavaan perinteisten vasta-aineiden avulla tehtyyn määritykseen. Bispesifisten sitojien avulla tehdyn määrityksen signaalitaso oli korkeampi ja sen avulla pystyttiin havaitsemaan pienempi troponiinipitoisuus kuin perinteisellä määrityksellä. Sitojien valmistusmenetelmää kehittämällä pystyttäisiin niiden kokoa edelleen pienentämään nykyisestä ja pienempi koko puolestaan nopeuttaisi kiinnittymistä kohdemolekyyliin. Hyöty diagnostisissa sovelluksissa olisi merkittävä, koska kohdemolekyylin, kuten troponiinin, pitoisuus veressä pystyttäisiin määrittämään entistä nopeammin. 13

14 Kohti sydäninfarktin varhaisempaa ja nopeampaa diagnosointia Laura Mehtälä Ohjaaja: FT Lasse Välimaa MOLEKULAARINEN BIOTEKNIIKKA JA DIAGNOSTIIKKA Erikoistyössä kehitetyllä määrityskonseptilla voidaan tulevaisuudessa havaita sydäninfarkti varhain ja vain 15 minuutissa. Sydäninfarktin aiheuttaa äkillinen hapenpuute, joka johtaa kuolioon sydänlihaksessa. Suomessa sydäninfarktin saa henkilöä vuodessa ja siihen liittyviä kuolemia vuodessa on Sydäninfarkti voidaan havaita merkkiaineesta, sydänlihaksen vaurioituessa verenkiertoon vapautuvasta sydänperäisestä troponiini I (ctni) proteiinista, joka ei ole mitattavissa terveen henkilön verestä. Nopean määrityksen ja näin myös nopean diagnoosin etuna on varhainen päätös potilaan jatkohoidosta. Työn tavoitteena oli kehittää sydäninfarktin varhaiseen diagnosointiin noin pankkikortinkokoinen testikasetti, joka olisi tarpeeksi herkkä tunnistamaan pienetkin merkkiainepitoisuudet vain 15 minuutissa. Merkkiaineen pitoisuus verestä havaitaan mittaamalla merkkiaineen tunnistavan nanopartikkelileiman erityisen voimakasta valoa, mihin määrityksen kyky tunnistaa pienetkin merkkiainepitoisuudet osaltaan perustuukin. Toinen määrityksen herkkyyttä lisäävä tekiä on mikrofluidinen kanavisto, jossa kaksivaiheinen immunomääritys on mahdollista toteuttaa pienillä liuostilavuuksilla kasetille painettujen kanavien ja nestesäilöjen avulla. Pienten kasettien muita etuja ovat niiden helppokäyttöisyys sekä valmistuksen kustannustehokkuus. Tällä hetkellä sydäninfarktimääritys toimii testikasetilla vaaditussa pienessä nestetilavuudessa ja vaaditussa lyhyessä määritysajassa. Määrityskonseptin kehitystyö jatkuu edelleen ja lisää tutkimusta tarvitaan, jotta päästään pienempienkin troponiinipitoisuuksien nopeaan havaitsemiseen verinäytteestä testikasetilla. 14

15 CACNA1D- ja ACSM1-merkkiaineiden käyttö eturauhassyöpädiagnostiikassa Yifeng Li Ohjaajat: FM Saeid Alinezhad, FM Riina-Minna Väänänen ja prof. Kim Pettersson MOLEKULAARINEN BIOTEKNIIKKA JA DIAGNOSTIIKKA Uusien käänteiskopiointi-pcr-määritysten avulla voidaan määrittää herkästi ja spesifisesti CACNA1D- ja ACSM1-geenien ilmentymistasot eturauhas-kudoksesta. Sekä CACNA1D:n (engl. voltage-dependent L-type calcium channel subunit alpha- 1D) että ACSM1:n (engl. acyl-coenzyme A synthetase) ilmentymistasojen havaittiin olevan kohonneita eturauhassyöpäkudoksissa. CACNA1D-geenin ilmentymistaso oli terveisiin eturauhaskudoksiin verrattuna 6,4 kertaa korkeampi eturauhassyöpäpotilaan hyvänlaatuisissa kudoksissa ja 13 kertaa korkeampi syöpäkudoksissa. ACSM1-geenin ilmentymistaso oli 14 kertaa korkeampi eturauhassyöpäpotilaan hyvänlaatuisissa kudoksissa ja 28 kertaa korkeampi syöpäkudoksissa kuin terveissä eturauhaskudoksissa. Näitä merkkiaineita voidaan mahdollisesti käyttää muiden merkkiaineiden kanssa toisiaan täydentävinä eturauhasdiagnostiikassa. Erikoistyössä tutkittiin CACNA1D- ja ACSM1-merkkiaineiden käyttöä eturauhassyöpädiagnostiikassa, sillä kirjallisuudesta löytyvien tietojen perusteella niiden on havaittu olevan yhteydessä eturauhassyöpään ja CACNA1D-geeni nimenomaan aggressiiviseen syöpämuotoon. Eturauhassyöpä on yleisimmin todettu syöpä miehillä ja sen ilmaantuvuus suurenee 50 ikävuoden jälkeen. Tällä hetkellä käytetyimmässä varhaisdiagnosointimenetelmässä, eturauhasspesifisen antigeenin (PSA) määrittämisessä, on kuitenkin puutteita. PSA ei ole syöpäspesifinen, ja sen pitoisuus kohoaa veressä monista syistä. Lopullinen syöpädiagnoosi tehdäänkin kudosnäytteen perusteella, mutta senkään avulla ei pystytä erottamaan välitöntä hoitoa vaativaa, aggressiivista eturauhassyöpää vaarattomasta, hitaasti etenevästä. Tämä johtaa useimmiten eturauhassyöpäpotilaan ylihoitamiseen. Tästä syystä uusia lupaavia eturauhassyöpämerkkiaineita etsitään jatkuvasti. 15

16 Infektion aiheuttavan bakteerin tunnistus nopeasti ja turvallisesti Laura Joki Ohjaajat: FM Susanne Lahdenperä ja FM Ulla Karhunen MOLEKULAARINEN BIOTEKNIIKKA JA DIAGNOSTIIKKA Työn tarkoituksena oli kehittää määritys, jonka avulla infektion aiheuttanut bakteeri voitaisiin tunnistaa nopeasti ja turvallisesti. Sairastuneille potilaille voitaisiin antaa juuri oikea antibiootti sen sijaan, että potilaita hoidettaisiin laajakirjoisilla antibiooteilla, jotka tehoavat moniin eri bakteereihin. Oikean antibiootin valinnalla antibiooteille vastustuskykyisten bakteerien yleistymistä voitaisiin hidastaa. Määrityksessä näyte sekä bakteerin DNA:ta monistavat ja havaitsevat komponentit suljetaan samaan reaktioastiaan. Bakteerin DNA:ta monistuu, jos bakteereja on ollut alkuperäisessä näytteessä. Monistuksen jälkeen tuote voidaan havaita valoa tuottavien leimojen avulla. Nämä leimat tuottavat valoa ainoastaan, jos bakteerin DNA on monistunut. Määritys on turvallinen, sillä reaktioastiaa ei avata missään vaiheessa näytteen lisäämisen jälkeen. Lisäksi määrityksen tulos olisi valmis tunneissa, kun taas esimerkiksi veriviljelyn avulla saatavan tuloksen saaminen kestää pahimmillaan useita vuorokausia. Tässä työssä on kehitetty optimaalinen monistusreaktio mallibakteeri Pseudomonas aeruginosalle. Samassa reaktioastiassa monistettiin myös kontrolli-dna:ta minkä avulla voitiin todeta monistusreaktion toimivuus. Lopullisen määrityksen edellytyksenä on toisen leimamolekyylin kovalenttinen sitoutuminen muovipintaan.lisäksi työssä vertailtiin eri muovipintojen kykyä sitoa leimamolekyyliä. Valmista määritystä voitaisiin hyödyntää monien eri bakteeriperäisten sairauksien diagnostiikassa. 16

17 Testi pikavauhtia levinneen CTX-M-antibioottiresistenttiyden havaitsemiseen Titta Oksala Ohjaaja: FT Saara Wittfooth MOLEKULAARINEN BIOTEKNIIKKA JA DIAGNOSTIIKKA Antibioottien käytön lisääntyessä uhkaavaksi ongelmaksi ovat muodostuneet antibioottiresistentit bakteerikannat, joille on geenimutaatioiden myötä kehittynyt kyky sietää antibiootteja luvulla maailmanlaajuisesti levinnyt CTX-M on antibioottiresistenttiys, jossa bakteeri puolustautuu erityisesti useita kefalosporiini-antibiootteja vastaan pilkkomalla niitä tuottamallaan entsyymillä. Erikoistyössä kehitettiin CTX-M-geenin aiheuttaman antibioottiresistenttiyden havaitsemiseen herkkä ja luotettava testi, jolla voidaan mahdollisesti tunnistaa paremmin kyseistä geeniä kantavat bakteerit. CTX-M-antibioottiresistenttiyden havainnointi perustuu vielä nykyään entsyymin tuoton varmistaviin testeihin. Kyseiset testit ovat kuitenkin aikaa vieviä ja voivat antaa epäluotettavia tuloksia. Entsyymiä tuottavan geenin havaitsevilla määrityksillä sen sijaan voidaan nopeuttaa tulosten saantia ja parantaa testin luotettavuutta. CTX-Mgeenin tunnistavia kaupallisia testejä on vielä vähän, ja oman haasteensa niiden kehittämiselle tuovat yli sata erilaista CTX-M-geenin mutatoitunutta muotoa, jotka kaikki tulisi tunnistaa positiivisiksi. Testi ei kuitenkaan saisi tunnistaa CTX-M-geenin kaltaisia muita geenejä. Erikoistyössä kehitettiin CTX-M-geenin havaitseva testi, jossa osa näytteen CTX-Mgeenistä monistetaan ja havaitaan Turun yliopiston biotekniikan osastolla kehitettyä erittäin tehokasta leimateknologiaa hyödyntäen. Alustavissa testauksissa testi tunnisti kaikki CTX-M-geeniä kantaneiden bakteerien näytteet positiivisiksi ja muiden bakteerien näytteet negatiivisiksi. Testi pystyi myös havaitsemaan hyvin pieniäkin määriä bakteeri-dna:ta sisältäneet CTX-M-näytteet positiivisiksi. Tulosten perusteella testi voisi sopivaan näytteiden esikäsittelymenetelmään ja helppokäyttöiseen testialustaan yhdistettynä soveltua hyvin potilasnäytteiden CTX-Mtestaukseen. 17

18 Uusi leimayhdiste polymeerin kulutuksen seurantaan vesiteollisuudessa Niina Perälä Ohjaaja: FM Markus Vehniäinen MOLEKULAARINEN BIOTEKNIIKKA JA DIAGNOSTIIKKA Varauksellisia polymeerejä käytetään apuaineina monissa eri teollisuuden prosesseissa, kuten vedenpuhdistuksessa. Yleisimmin niiden tarkoituksena on poistaa veteen liuenneita haitallisia aineita. Polymeerien oikea annostelu on tärkeää sekä tuotetun veden laadun että taloudellisten syiden takia. Tästä johtuen polymeerien kulutuksen seurantaan on ollut tarvetta kehittää herkkä ja nopea menetelmä. Erikoistyössä tutkittiin polymeeriä, joka ehkäisee korroosiota edesauttavan kattilakiven muodostumista ruostumiselle alttiissa putkistoissa. Polymeerin rakenteeseen oli sisällytetty leima-aine, jonka avulla yhdiste kyetään havaitsemaan prosessivedestä. Tämä mahdollistaa yksinkertaisen tavan seurata polymeerin kulumista prosessissa ja näin ollen reagoida nopeasti annostelun muutostarpeeseen. Leimattu polymeeri osoittautui tutkimuksissa kestäväksi yhdisteeksi ja se oli havaittavissa vedestä hyvin pienissä pitoisuuksissa. Yhdiste osoittautuikin lupaavaksi tuotteeksi uuden seurantajärjestelmän kehittämiseksi. 18

19 Epäilyttääkö mökkirannan vedessä oleva kasvusto: Myrkkyjä tuottavien syanobakteerien DNA-pohjainen havaitsemismenetelmä Mikko Preede Ohjaaja: FM Henna Hautala MOLEKULAARINEN BIOTEKNIIKKA JA DIAGNOSTIIKKA Erikoistyössä kehitettiin menetelmä syanobakteerien tuottamien myrkkyjen, saksitoksiinien ja mikrokystiinien, taustalla olevien geenien havaitsemiseen. Määrityksellä pystyttiin erottamaan mikrokystiiniä tuottavat ja tuottamattomat syanobakteerit toisistaan ja sen soveltuvuus myös saksitoksiinia tuottaville syanobakteereille todistettiin. Määrityksen etuna moniin muihin DNA-pohjaisiin määrityksiin nähden on sen tarjoama mahdollisuus havaita yhtäaikaisesti monia eri toksiineja tuottavia syanobakteereita. Se myös vähentää tunnistamiseen tarvittavaa aikaa ja työtä koska jokaista eri myrkkyä tuottavaa kantaa ei tarvitse tunnistaa erikseen vaan asia selviää yhdellä testillä. Etuna on myös se että toisin kuin suoraan myrkkyjä mittaamalla, DNA-pohjaisella menetelmällä voidaan ennakoida haitallisten syanobakteerien lisääntymistä ja näin varautua etukäteen mahdollisiin haittoihin. Syanobakteerit, joita kansanomaisesti kutsutaan sinileviksi, eivät ole leviä vaan bakteereja, jotka kykenevät fotosynteesiin kuten kasvit ja levät. Niitä esiintyy meri- ja makeissa vesissä ympäri maapallon, ja niiden massaesiintymiset ovat lisääntyneet vesistöjen lämpenemisen ja rehevöitymisen takia. Osa syanobakteereista tuottaa myrkkyjä, jotka voivat olla haitallisia hermostolle ja maksalle. Näiden joukossa on vahvimpia tunnettuja luonnossa esiintyviä myrkkyjä. Juomaveden kautta ne voivat suoraan myrkyttää niin kotieläimiä kuin ihmisiäkin ja voivat estää vesistöjen virkistyskäytön. Ne voivat aiheuttaa myös huomattavia taloudellisia menetyksiä kalankasvattomoille ja simpukkaviljelmille. Tämän takia myrkkyä tuottavien syanobakteerien tunnistaminen on tärkeää. 19

20 Diabeteksen jäljillä Vesa Pönkkä Ohjaajat: FM Ari Lehmusvuori ja FT Minna Kiviniemi MOLEKULAARINEN BIOTEKNIIKKA JA DIAGNOSTIIKKA Työssä onnistuttiin kehittämään menetelmä, jolla yhdestä veritäplänäytteestä saadusta DNA:sta onnistuttiin detektoimaan kahta tiettyä alleelia. Nämä alleelit voivat kasvattaa riskialttiutta sairastua nuoruustyypin diabetekseen. Kaikilla testatuilla näytteillä saatiin oikeita tuloksia. Menetelmä perustui kelaattikomplementaatioon. Siinä kaksi leimaoligoa, lantanidikelaatti ja antenna, sitoutuvat lähekkäin kun ne tunnistavat oikean ainutlaatuisen kohdan etsittävästä alleelista. Lähekkäin ne muodostavat kompleksin, jonka avulla alleeli voidaan havaita. Työssä käytettiin kahta erilaista kelaattia, europiumia ja terbiumia, jotta molempia alleelia voitaisiin etsiä yhtä aikaa. Veritäplänäytteistä saatu DNA monistettiin asymmetrisessä PCR:ssä ja molempia alleeleja detektoitiin yhtä aikaa. 20

21 Määrityksen kehitys endometrioosin diagnostiikkaan Liisa Hattara Ohjaajat: FT Taija Saloniemi-Heinonen ja FT Harri Siitari MOLEKULAARINEN BIOTEKNIIKKA JA DIAGNOSTIIKKA Työn tavoitteena oli kehittää määritys endometrioosin diagnoosin, ennustamisen ja hoidon seurannan parantamiseksi. Nykyään tähän tarkoitukseen ei ole olemassa riittävän hyvää määritystä. Lopullinen diagnoosi voidaan tehdä vain tähystysleikkauksen yhteydessä. Endometrioosista eli kohdun limakalvon sirottumataudista kärsii arviolta 6-10 % hedelmällisessä iässä olevista naisista. Lisääntymisongelmista kärsivistä naisista jopa % sairastaa endometrioosia. Taudissa kohdun limakalvon kaltaista kudosta kasvaa kohdun ulkopuolella esimerkiksi munasarjoissa tai vatsaontelossa. Endometrioosi aiheuttaa tavallista voimakkaampia kuukautiskipuja, yhdyntäkipuja, voimakkaita kroonisia lantiokipuja sekä lapsettomuutta. Määrityksessä potilaan seerumi- tai virtsanäytteestä mitataan endometrioosin merkkiaineita niitä tunnistavien vasta-aineiden avulla. Määrityksen käytettävyyttä tullaan arvioimaan vertailemalla endometrioosipotilaiden näytteitä terveiden naisten verrokkinäytteisiin. Mikäli määritys osoittautuu toimivaksi, se olisi merkittävä edistysaskel endometrioosia sairastavien naisten taudin toteamiselle. 21

22 Teho-osastoille suunnatun pikatestin kehittäminen verenmyrkytyksen diagnostiikkaan Anu Peuralahti Ohjaaja: FT Kaj Blomberg, DHR Finland Oy, Innotrac diagnostics MOLEKULAARINEN BIOTEKNIIKKA JA DIAGNOSTIIKKA Erikoistyössä saatiin pystytettyä infektiodiagnostiikassa käytettävä määritys, jossa voidaan mitata pieniä prokalsitoniinipitoisuuksia. Prokalsitoniinipitoisuudet mitataan potilaan kokoverestä, seerumista tai plasmasta. Prokalsitoniini on infektiomerkkiaine, jonka pitoisuus kasvaa bakteeri-infektioissa, esimerkiksi sepsiksessä eli verenmyrkytyksessä ja septisessä shokissa merkittävästi. Verenmyrkytyksen todentaminen on määrityksen tärkein käyttöalue. Verenmyrkytyksen diagnostiikassa tärkeää on testituloksen saaminen nopeasti ja se, että käytetty määritys on herkkyydeltään riittävä. Määrityksen herkkyydellä tarkoitetaan pienintä havaittavaa kohdemolekyylin, eli tässä määrityksessä prokalsitoniinin, pitoisuutta. Erikoistyön tarkoitus oli kehittää teho-osastoille suunnattu pikatesti, joka mittaa minuutissa veren prokalsitoniinipitoisuuden. Prokalsitoniinipitoisuuden mittausta käytetään sepsiksen diagnosoinnissa ja nopea määritys on tärkeä, jotta lääkitys voidaan aloittaa mahdollisimman pian. Määritys on immunomääritys, eli kohdemolekyylin tunnistamiseen näytteestä käytetään vasta-aineita. Päätarkoitus oli löytää sopiva kohdemolekyyliä tunnistava vasta-ainepari ja pystyttää vasta-aineilla määritys, jonka herkkyys on riittävä sepsiksen todentamiseksi. Määrityksessä kohdemolekyylin näytteestä tunnistavaan vasta-aineeseen on kiinnitetty valoa tuottava leima, jonka tuottaman valon määrään perustuen pystytään tarkasti määrittämään prokalsitoniinin pitoisuus näytteessä. Erikoistyössä osoitettiin, että prokalsitoniinimäärityksen herkkyyttä saatiin riittävästi parannettua valitsemalla uusia, kohdemolekyylin näytteestä tunnistavia vastaainepareja. Kuitenkin saatujen tulosten toistettavuuden kanssa oli ongelmia. Lisäksi käyttämällä pienempiä pilkottuja vasta-ainepalasia kokonaisen vasta-aineen sijaan, sekä vaihtamalla valoa tuottavaa leima Innotracissä kehitettyyn toiseen valoa tuottavaan leimaan, tähtikelaattiin, määrityksen herkkyys parani huomattavasti. Erikoistyössä kehitettyä määritystä verrattiin laajasti kliinisessä käytössä olevaan ja kaupallisesti saatavilla olevaan prokalsitoniinimääritykseen, mutta kehitetty määritys vaatii vielä hieman parantamista. Erikoistyöstä saadut tulokset osoittavat, että pystytetty määritys on lupaava ja lähellä tavoitteita ja pienellä jatkokehityksellä siitä saadaan kaupalliseen kliiniseen käyttöön soveltuva määritys. 22

23 Bioremediaation seurantamenetelmät Pauli Siivonen Ohjaajat: FM Shinjini Mukherjee ja FT Kim Yrjälä MOLEKULAARINEN BIOTEKNIIKKA JA DIAGNOSTIIKKA Suomessa on yli maaperältään saastunutta kohdetta. Maaperän joutunut öljy tai muu vastaava saaste voidaan poistaa biologisella kunnostuksella, bioremediaatiolla. Erikoistyössä selvitettiin maaperän biologisen kunnostuksen etenemisen seuraamisen mahdollistavia menetelmiä, jotka voisivat soveltua Luumäellä sijaitsevan Somerharjun entisen puunkyllästämön kreosootilla saastuneen maan biologisen kunnostuksen seurantaan. Valittuja seurantamenetelmiä olivat maan hengitys, entsyymiaktiivisuus määritys, potentiaalinen nitrifikaatioaktiivisuus, sekä mikrobipopulaatioiden rakenneanalyysi DNA menetelmällä. Seurantamenetelmien lisäksi etsittiin saastuneesta maasta siellä jo olevia polysyklisten aromaattisten hiilivetyjen (PAH) - hajottaja mikrobeja. Seurantamenetelmistä havaittiin Luumäelle sopiviksi entsyymiaktiivisuusmääritys, maan hengitys ja mikrobipopulaatioiden seuranta. Saastuneesta maasta onnistuttiin eristämään potentiaalisia PAH -hajottajia, mutta ei kyetty osoittamaan eristetyissä bakteereissa hajottajageenien olemassaoloa käytetyillä alukkeilla. Maaperän biologisen kunnostuksen seurannassa halutaan tarkkailla maaperän biologista aktiivisuutta. Potentiaalisen nitrifikaatioaktiivisuuden määrityksessä mitattiin nitriitin muodostumista, joka kuuluu osana typenkiertoon. Maan hengityksessä analysoitiin maassa olevien mikrobien aktiivisuutta hiilidioksidin tuoton eli hengityksen avulla. Entsyymiaktiivisuus määrityksellä selvitettiin yleisesti erilaisten entsyymiryhmien aktiivisuutta maaperässä. Mikrobipopulaatioiden rakenne vaikuttaa saasteiden hajoamiseen. Seurannassa tarkoituksena on saada tietoa mikrobipopulaatioista kunnostuksen eri vaiheissa. Eristysmenetelmässä saatiin maaperästä kasvamaan mikrobeja, jotka kasvoivat ympäristössä, jonka ainoana ravinnonlähteenä toimivat PAH -yhdisteet. Mikrobipopulaatioden muutosten tuntemus mahdollistaa bioremediaation prosessin nykyistä tehokkaamman ohjaamisen oikeaan suuntaan, ja se vaatii DNA -menetelmien käyttöä. Maaperän mikrobien eristäminen on haasteellista, koska vain pieni osa mikrobeista kasvaa laboratorio-olosuhteissa. T- RFLP on DNA -sormenjälkimenetelmä, jonka avulla voidaan tunnistaa maaperästä eristetyn DNA:n perusteella mikrobiyhteisön rakenne. Menetelmän etu on se, että sillä voidaan tunnistaa suoraan maan bakteeri-dna. Menetelmässä monistetaan 16S rdna merkkigeeniä, joka on kaikissa bakteereissa. Pilkkomalla DNA saadaan tuloksena eri pituisia DNA:n palasia, jotka ovat ominaisia kullekin bakteeriryhmälle. Bakteeriryhmät voidaan tunnistaa käyttämällä DNA -datapankkia minne bakteerien 16S sekvenssit on talletettu. 23

24 Uusia työkaluja sepelvaltimotaudin tutkimukseen Katja Marttunen Ohjaajat: FT Janita Lövgren ja FM Tuomas Huovinen LÄÄKEKEHITYSTIEDE Sepelvaltimotaudin tutkimista varten on kehitteillä uusia työkaluja. Tutkimalla terveiden ja sepelvaltimotautia sairastavien ns. hyvän kolesterolin, HDL:n, eroja saadaan lisätietoa HDL:n suojaavista vaikutuksista ja mekanismeista. Tällä hetkellä pisimmälle kehityksessä on edennyt PON1 nimistä proteiinia tunnistava vasta-aine. PON1:n on sitoutunut HDL-kolesteroliin ja se suojaa tulehdukselta, joten sepelvaltimotaudin kehittyminen hidastuu. Tutkimuksen jatkotavoitteena on kehittää laboratoriomääritys, jolla voitaisiin merkkiaineen avulla tunnistaa PON1 verestä ja seerumista. Samankaltaisia vasta-aineita on kehitteillä myös muita proteiineja, kuten ApoJ:tä ja ApoM:ää vastaan. Määrityksiä voidaan mahdollisesti käyttää sairauksien riskinarvioinnissa ja perustutkimuksessa. 24

25 Verensokeritestien valmistusmenetelmää voidaan parantaa Anna Ahomaa Ohjaajat: FM Tiina Myyryläinen, FT Nelli Steinke ja FT Carina Horn BIOTEKNIIKKA DI Diplomityössä kehitettiin uutta verensokeritestien valmistusmenetelmää. Uudella menetelmällä pystytään suuria testimääriä tuottamaan entistä helpommin, ja se vähentää henkilötyön tarvetta mahdollistaen alemmat tuotantokustannukset. Säännöllinen verensokerin tarkkailu on ensiarvoisen tärkeää diabetespotilaille. Verensokerimittauksen voi suorittaa helposti ja nopeasti kertakäyttöisten testilastujen avulla. Nämä lastut valmistetaan monimutkaisesta seoksesta, joka pinnoitetaan muovikalvolle. Jotta verensokeritesti toimisi parhaalla mahdollisella tavalla, on pinnoituksen oltava tasainen ja kestävä. Pinnoittamiseen käytettävän laitteen ominaisuudet, kuivatustapa sekä pinnoitteen koostumus vaikuttavat olennaisesti valmiin testin toimivuuteen. Parhaan pinnoitereseptin löytämiseksi eri ainesosien pitoisuuksia muuteltiin ja valmiiden testilastujen laatua ja toimivuutta arvioitiin sekä silmämääräisesti että testaamalla niiden suorituskykyä varsinaisessa verensokerimittauksessa. Pinnoitteen täyteaineena käytettävän silikan havaittiin suurina pitoisuuksina tekevän pinnoituksesta haperan. Myös korkeat sidosainepitoisuudet heikensivät pinnoitetta. Pinnoitemassan sekoittumista tehostava polyakryylihapon natriumsuola paransi pinnoitteen tasalaatuisuutta jo alhaisina pitoisuuksina. Parhaaksi valittua pinnoitekoostumusta käyttäen on työn seuraavassa vaiheessa tavoitteena määrittää uuteen menetelmään sopivimmat kuivatusolosuhteet. 25

26 Vieritestauslaitteen immunomääritysten herkkyyden parantaminen mallianalyyttinä troponiini I Mikael Jämsä Ohjaajat: FM Tanja Savukoski ja FT Harri Takalo BIOTEKNIIKKA DI Vieritestauksella tarkoitetaan testausta, joka tehdään potilaan lähellä esimerkiksi ambulanssissa tai lääkärin vastaanotolla. Tällöin tulokset saadaan nopeammin kuin sairaaloiden keskuslaboratorioista. Työn tarkoituksena oli parantaa vieritestauslaitteen immunomääritysten herkkyyttä. Mallianalyyttinä käytettiin sydäninfarktin havaitsemiseen käytettävää proteiinia, sydänperäistä troponiini I:tä, jota vapautuu verenkiertoon sydänlihaksen vaurioituessa. Uuden, leimana käytettävän europiumkelaatin avulla määrityksen herkkyys parantui viisinkertaisesti nykyiseen kelaattiin verrattuna. Lisäksi sitojapinnan sitomiskyky kasvoi viisinkertaisesti käytössä olevaan sitojapintaan verrattuna. Myös mittauslaitteen ominaisuuksia optimoimalla herkkyys parani 1,5-kertaisesti. Herkkyyteen vaikuttavista menetelmistä lupaavimmalta vaikutti uusi kelaatti. Sen käyttö kuitenkin edellyttää, että uuden kelaatin aiheuttama taustan nousu saadaan estettyä. Parantunut herkkyys voisi tällöin nopeuttaa sydäninfarktin diagnosointia. Lisäksi uuden kelaatin tuoma hyöty voitaisiin siirtää muihin analyytteihin. 26

27 Uusi tutkimusmalli syövän syntyä ja kasvua edistävän proteiinin tutkimiseen Inga Pukonen Ohjaajat: FM Anni Laine, FT Janita Lövgren ja prof. Jukka Westermarck BIOTEKNIIKKA DI Syöpäsolujen kasvua lisäävän CIP2A-proteiinin tutkimukseen on kehitetty uusi eläinmalli, joka tulee toimimaan tärkeänä työkaluna CIP2A:n roolin tutkimisessa ihmisen syövässä. Syövän synty vaatii muutoksia proteiinien toiminnassa Normaalien solujen muuntuminen syöpäsoluiksi on monivaiheinen prosessi, joka vaatii muutoksia sekä solun kasvua rajoittavien että kasvua edistävien proteiinien toiminnassa. Yleisesti vallitsevan käsityksen mukaan kasvunestäjäproteiini PP2A:n toiminnan esto on yksi välttämättömistä muutoksista normaalien solujen muuttuessa syöpäsoluiksi. CIP2A (Cancerous Inhibitor of PP2A) proteiinin on osoitettu estävän tämän PP2A proteiinin aktiivisuutta. Aikaisemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että CIP2A-proteiinin tuotanto on lisääntynyt monissa ihmisen syövissä. Uusi eläinmalli antaa uutta tietoa CIP2A:n toiminnasta ja roolista syövässä Tässä tutkimustyössä osoitettiin uuden konditionaalisen CIP2A-loxP hiirimallin toimivuus. Lisäksi CIP2A-proteiinin tuottoa soluissa pystytään tässä mallissa säätelemään ja näin tutkimaan proteiinin toimintaa ja roolia syövässä. CIP2A proteiinin toiminnan estäminen voisi tulevaisuudessa tarjota uusia mahdollisuuksia syövän hoitoon. 27

28 Uudenlainen pikatesti potilasläheiseen diagnostiikkaan Merja Lahdenranta Ohjaajat: FM Etvi Juntunen, Teppo Salminen, FM Tiina Myyryläinen ja prof. Kim Pettersson BIOTEKNIIKKA DI Diplomityössä kehitettiin uudentyyppistä määritysalustaa, joka soveltuu diagnostisten testien tekemiseen laboratorioiden ja sairaalaolosuhteiden ulkopuolella, esimerkiksi potilaan omassa kodissa tai ambulanssissa. Määritysalustan prototyypillä on saatu lupaavia tuloksia sydänkohtausmerkkiaineen (sydänperäinen troponiini I) sekä hepatiitti B viruksen määrityksissä. Määritysalustalla voidaan tulevaisuudessa tehdä useita erilaisia diagnostisia määrityksiä. Määritysalustasta pyrittiin kehittämään helppokäyttöinen ja tehokas. Nykyään vastaavissa olosuhteissa tehtävistä määritysmenetelmistä yleisimpiin kuuluu lateraalivirtausmääritys. Lateraalivirtausmääritys perustuu nesteen liikkumiseen kalvolla. Uuden määritysalustan menetelmä perustuu havaittavan aineen ja siihen sitoutuneen leima-aineen kiinnittymiseen mikropartikkelin pintaan ja mikropartikkelien suodattamiseen. Uusi määritysalusta on yhtä yksinkertainen ja edullinen kuin lateraalivirtausmääritys, mutta ilman sen suorituskykyongelmia. 28

29 Uusi tutkimusmalli syövän syntyä ja kasvua edistävän proteiinin tutkimiseen Inga Pukonen Ohjaajat: FM Anni Laine, FT Janita Lövgren ja prof. Jukka Westermarck BIOTEKNIIKKA DI Syöpäsolujen kasvua lisäävän CIP2A-proteiinin tutkimukseen on kehitetty uusi eläinmalli, joka tulee toimimaan tärkeänä työkaluna CIP2A:n roolin tutkimisessa ihmisen syövässä. Syövän synty vaatii muutoksia proteiinien toiminnassa Normaalien solujen muuntuminen syöpäsoluiksi on monivaiheinen prosessi, joka vaatii muutoksia sekä solun kasvua rajoittavien että kasvua edistävien proteiinien toiminnassa. Yleisesti vallitsevan käsityksen mukaan kasvunestäjäproteiini PP2A:n toiminnan esto on yksi välttämättömistä muutoksista normaalien solujen muuttuessa syöpäsoluiksi. CIP2A (Cancerous Inhibitor of PP2A) proteiinin on osoitettu estävän tämän PP2A proteiinin aktiivisuutta. Aikaisemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että CIP2A-proteiinin tuotanto on lisääntynyt monissa ihmisen syövissä. Uusi eläinmalli antaa uutta tietoa CIP2A:n toiminnasta ja roolista syövässä Tässä tutkimustyössä osoitettiin uuden konditionaalisen CIP2A-loxP hiirimallin toimivuus. Lisäksi CIP2A-proteiinin tuottoa soluissa pystytään tässä mallissa säätelemään ja näin tutkimaan proteiinin toimintaa ja roolia syövässä. CIP2A proteiinin toiminnan estäminen voisi tulevaisuudessa tarjota uusia mahdollisuuksia syövän hoitoon. 29

30 Synteesilaboratorion muutto laatujärjestelmä huomioiden Pauli Puumala Ohjaajat: FM Jaana Rosenberg, FM Sami Pinta (PerkinElmer) BIOTEKNIIKKA DI Diplomityön tarkoituksena oli suunnitella ja toteuttaa PerkinElmer Turun yksikön orgaanisen kemian synteesilaboratoriotilojen muutto uusiin toimintatiloihin siten, että kaikki toiminnot toteutetaan yrityksen oman laadunhallintajärjestelmän mukaisesti. Muuton lähtökohtana oli ratkaista laboratoriotiloissa ilmenneiden epäkohtien aiheuttamat työturvallisuusriskit. Riskeihin luettiin kuuluvan etenkin kesäisin kohonneen sisälämpötilan aiheuttama liuottimien höyrystymisriski, sekä tiloihin asennettu halotron-sammutusjärjestelmä. Tilat olivat tämän lisäksi ahtaat sekä väliovelliset, joiden katsottiin vaikuttavan työskentelymukavuuteen. Ratkaisuna esitettyihin ongelmiin synteesilaboratorion työskentelytilat muutettiin uusiin tiloihin. Muuton suunnittelu sekä toteutus suoritettiin laatimalla validointisuunnitelma, jossa kuvattiin mitä tehtäisiin ja miten muutto toteutetaan. Siirtyvien laitteiden ja tilojen soveltuvuus uudelleenkäyttöön testattiin ja raportoitiin muuton jälkeen. Muuton yksityiskohdat kuvattiin kirjallisessa validointiraportissa. Muuton suorituksen jälkeen jatkotoimenpiteinä päivitettiin tilojen laitelistaluettelo sekä päivitettiin yrityksen ohjekuvauksia muuttuneen sisällön osalta. Synteesilaboratorion muuton toteutus onnistui validointisuunnitelman mukaisesti ilman poikkeamia sekä työntekijöiltä kerätty palaute muuton vaikutuksesta oli valtaosin erittäin positiivista. Täten voidaan päätellä muuttoprojektin onnistuneen hyvin. Asiasanat: laadunhallintajärjestelmä, validointi, kvalifiointi 30

31 Luminoivia lantanidi-ioneja hyödyntävä nukleiinihappojen monistuksen seurantalaite rakenteilla Mikko Pyykkö Ohjaajat: DI Juho Terrijärvi ja prof. Tero Soukka BIOTEKNIIKKA DI Nukleiinihappojen eli DNA:n monistamisen reaaliaikainen seuranta on osoittautunut käyttäjäystävällisimmäksi tavaksi tutkia DNA:n monistamista. Menetelmää voidaan parantaa hyödyntämällä luminoivia lantanidi-ioneja, joiden valon säteilyn pitkän eliniän ansiosta voidaan mittaus suorittaa viiveellä, joka vähentää mittausta häiritseviä tekijöitä. Rakenteilla on näitä menetelmiä hyödyntävä DNA:n monistuksen seurantalaite, jollaista ei ole tällä hetkellä kaupallisesti tarjolla. Tehdyssä työssä on testattu edullisista komponenteista rakennetun, valmiin luminesenssimittalaitteiston toimintaa ja saatu DNA:n monistusreaktio näkymään. Mittalaitteen valon tunnistus jäi kuitenkin heikommaksi kuin vertailuun käytetyllä mittalaitteella. Lisäksi DNA:n monistusreaktion aikaansaamiseksi on kehitetty lämpötilavaihtelija, joka on testattu riittävän tarkaksi ja nopeaksi. Näin ollen lämpötilavaihtelija soveltuu lisättäväksi valmiiseen luminesenssimittalaitteeseen. Nukleiinihappojen monistuksen seurantalaitteen suorituskyvyn ja valmiin laitteen testaaminen ovat toistaiseksi vielä kesken. 31