YLI-ILMENTYVÄN ANDROGEENIRESEPTORIN VOIMISTUNUT SITOUTUMINEN KROMATIINIIN LISÄÄ DTL:N JA TPX2:N ILMENTYMISTÄ KASTRAATIORESISTENTISSÄ ETURAUHASSYÖVÄSSÄ

Transkriptio

1 YLI-ILMENTYVÄN ANDROGEENIRESEPTORIN VOIMISTUNUT SITOUTUMINEN KROMATIINIIN LISÄÄ DTL:N JA TPX2:N ILMENTYMISTÄ KASTRAATIORESISTENTISSÄ ETURAUHASSYÖVÄSSÄ Salla Säilynoja Syventävien opintojen kirjallinen työ Tampereen yliopisto Biolääketieteellisen teknologian yksikkö Eturauhassyövän molekyylibiologian tutkimusryhmä Tammikuu 2012

2 Tampereen yliopisto Biolääketieteellisen teknologian yksikkö Eturauhassyövän molekyylibiologian tutkimusryhmä SÄILYNOJA SALLA: YLI-ILMENTYVÄN ANDROGEENIRESEPTORIN VOIMISTUNUT SITOUTUMINEN KROMATIINIIN LISÄÄ DTL:N JA TPX2:N ILMENTYMISTÄ KASTRAATIORESISTENTISSÄ ETURAUHASSYÖVÄSSÄ Kirjallinen työ, 24 s. Lähiohjaaja: Alfonso Urbanucci, FM Ohjaaja: Professori Tapio Visakorpi, LT Toukokuu 2012 BUB1B, PVT1, 5α-dihydrotestosteroini, LNCaP, ChIP, Q-RT-PCR Eturauhassyöpä on miesten yleisin syöpä länsimaissa. Eturauhassyöpä saattaa muuttua suotuisan hoitovasteen jälkeen kastraatiolle vastustuskykyiseksi eturauhassyöväksi, johon ei ole olemassa tehokasta hoitoa. Kastraatioresistentin syövän kehittyminen liittyy androgeenireseptorin (AR) yliilmentymiseen. Yli-ilmentymisen vaikutusten selvittämistä varten on kehitetty AR:a eri tasoilla ilmentäviä solulinjoja, joita hyödyntäen on tunnistettu matalassa 5α-dihydrotestosteroinipitoisuudessa (DHT) ilmentyviä AR:n säätelemiä geenejä. Lisäksi solulinjojen avulla on osoitettu, että AR sitoutuu säätelemiensä geenien promoottorialueen läheisyyteen. Tässä työssä tutkittiin reaaliaikaisella käänteistranskriptio-pcr-menetelmällä (Q-RT-PCR) geenien TPX2, BUB1B, DTL ja PVT ilmentymistä kliinisissä näytteissä sekä LNCaP-solulinjoissa, joita oli käsitelty eri DHTpitoisuuksissa. Lisäksi työssä selvitettiin AR:n sitoutumista geenien säätelyalueille kromatiinin immunosaostus- ja Q-PCR-menetelmällä. Tutkimuksessa osoitettiin, että DTL ja TPX2 yliilmentyvät kastraatioresistentissä syövässä. Lisäksi todistettiin, että DHT-konsentraation ja ARreseptorin määrällä on vaikutusta TPX2:n, BUB1B:n ja DTL:n ilmentymiseen. Tämän lisäksi vahvistettiin, että AR-proteiinin määrän kasvu lisää sen tarttumista TPX2 ja DTL:n promoottorien läheisyyteen. Tulokset viittaavat siihen, että näillä geeneillä voi olla merkitystä eturauhassyövän muuttuessa kastraatioresistentiksi.

3 SISÄLLYS 1 JOHDANTO AINEISTO JA MENETELMÄT Kliiniset näytteet LNCaP-solulinjat ja soluviljely Geenien transkriptiotuotteiden kääntäminen komplementtaariseksi DNA:ksi Reaaliaikainen qrt-pcr-menetelmä Kromatiinin immunosaostus Sulamiskäyräanalyysi ja agaroosigeeliajo TULOKSET Geenien ilmentyminen solulinjoissa AR:n tarttuminen mahdollisiin säätelyalueisiin Geenien ilmentyminen kliinisissä näytteissä POHDINTA LÄHTEET LIITTEET... 20

4 1 1 JOHDANTO Eturauhassyöpä on miesten yleisin syöpä Suomessa. Keskimäärin 4598 ihmistä sairastui sekä 796 kuoli eturauhassyöpään jokaisena vuotena ajanjaksolla (NORDCAN-tilasto syövän esiintyvyydestä Suomessa. Eturauhassyövän yhteys androgeeneihin on havaittu jo 40-luvulla (Huggins ja Hodges 1972). Paikallisesti edenneessä tai metastoituneessa eturauhassyövässä androgeenien vaikutus voidaan poistaa antiandrogeeneillä, tai vaihtoehtoisesti niiden eritys voidaan estää kemiallisella tai kirurgisella kastraatiolla (Käypä hoito Terveysportti. Viimeaikaiset preventiotutkimukset (Andriole ym. 2010, Thompson ym. 2003) osoittavat, että eturauhassyövän esiintyvyys vähenee, kun 5α-reduktaasina inhibiittoreilla estetään androgeeneihin kuuluvan testosteronin muuttuminen aktiivisemmaksi dihydrotestosteroniksi (DHT). Eturauhassyöpä voi kuitenkin muuttua suotuisan hoitovasteen jälkeen hormonihoidoille reagoimattomaksi, kastraatioresistentiksi eturauhassyöväksi (CRPC = castration resistant prostate cancer), jolloin elinaikaa on jäljellä enää 1-2 vuotta ( Tutkimuksissa on osoitettu, että kastraatiosta huolimatta CRPC:n kehittyminen on edelleen androgeeneistä riippuvaista (Attard ym. 2009). Onkin ehdotettu, että syöpäsoluilla on kyky muuttaa lisämunuaiskuoren erittämiä androgeenejä dihydrotestosteroniksi (Stanbrough ym. 2006), tai vaihtoehtoisesti kastraatioresistentit solut pystyisivät tuottamaan androgeeneja kolesterolista (Locke ym. 2008, Montgomery ym. 2008, Seruga ym. 2011). Joka tapauksessa DHT-taso on CRPC:ssä huomattavasti alhaisempi hoitamattomaan syöpään verrattuna (Mohler ym. 2004), eikä siten täysin selitä CRPC:n kehittymistä. Onkin osoitettu, että jo vähäinen androgeenireseptorin (AR) yliilmentyminen herkistää CRPC-soluja matalille androgeenipitoisuuksille (Waltering ym. 2009). AR yli-ilmentyy lähes kaikissa hoidon aikana uusiutuneissa eturauhassyövissä (Linja ym. 2001). Yli-ilmentymisen on osoitettu olevan keskeinen tekijä CRPC:n kehittymisessä (Chen ym. 2004). Jo 15 vuotta sitten havaittiin, että AR:ää koodaava geeni on monistunut kolmasosassa kastraation aikana uusiutuneista eturauhassyövistä (Visakorpi ym. 1995). Myöhemmin on löydetty ligandispesifisyyttä muuttavia AR-pistemutaatioita antiandrogeeneillä hoidetuista syövistä (Taplin ym. 1995). Lisäksi on näyttöä, että kastraatioresistentit solut ilmentävät AR:n "splice variant" - muotoja, jotka johtavat reseptoriproteiinin konstitutiiviseen aktiivisuuteen (Hu ym. 2009). AR:n yliilmentymistä on myös selitetty RB-geenin häviämällä (Sharma ym. 2010). Viimeisimmän

5 tutkimuksen mukaan kuitenkin matala androgeenitaso estää negatiivisen palautejärjestelmän toimintaa, jolloin AR:n ilmentymistä rajoittavan säätelijän muodostuminen estyy (Cai ym. 2011). 2 AR on keskeinen proteiini eturauhassyövän kehittymisessä sekä syövän etenemisessä kastraatioresistenttiin vaiheeseen (Latil ym. 2001, Linja ym. 2001, Visakorpi ym. 1995). AR vaikuttaa satojen epiteelisolujen erilaistumiseen sekä solukasvuun liittyvien geenien luentaan. AR:n yli-ilmentymisen vaikutuksesta reseptorin sitoutuminen geenien säätelyalueille voimistuu, mikä selittää AR-singaloinnin uudelleen aktivoitumista CRPC:ssä (Urbanucci ym. 2011). Uusien terapioiden kehittämistä varten on keskeistä selvittää, mitkä AR:n säätelemät geenit ovat edellytyksenä CRPC:n kehitykselle. Toistaiseksi ainoastaan TMPRSS2-ERG-fuusiogeenillä on osoitettu olevan merkitystä eturauhassyövän synnyssä (Tomlins ym. 2005). Tulevaisuuden hoitomuodoissa pystyttäisiin inaktivoimaan vasta-aineilla geenien koodaamia proteiineja sekä estämään mrna:n toimintaa. AR:n yli-ilmentymisen vaikutuksien tutkimista varten on kehitetty AR:n suhteen tyhjällä vektorilla transfektoitu LNCaP-pcDNA3.1- kontrollisolulinja sekä AR:ää 5 6-kertaisesti (LNCaP-ARhi) ja 2 4-kertaisesti (LNCaP-ARmo) yli-ilmentävät solulinjat. Waltering ym. (2009) on määritellyt LNCaP-solulinjan avulla DHT-pitoisuudelle herkistyneitä geenejä, jotka ovat AR:n säätelemiä 1,5 kertaisesti 1 nm DHT:ssa 4 tai 24 tunnin aikapisteissä LNCaP-ARhi tai -ARmo-solulinjoissa. Urbanucci ym. (2011) on edelleen kartoittanut CRPC:n kehittymiseen vaikuttavia AR:n säätelemiä geenejä yhdistämällä Walteringin ym. (2009) tiedostot ChIP-seq-menetelmän avulla saatuun tietoon 250 kb etäisyydellä promoottorialueesta sijaitsevista AR:n sitoutumiskohdista (ARBS = androgen receptor binding site). Tässä työssä tutkitaan aikaisempien julkaisujen ja yllämainittujen tulosten (Waltering ym, 2009, Urbanucci ym, 2011) perusteella valittujen geenien TPX2:n, DTL:n, BUB1B:n ja PVT:n vaikutusta CRPC:n kehittymiseen kliinisten näytteiden avulla. Lisäksi työssä selvitetään AR:n ilmentymisen ja DHT-konsentraation yhteisvaikutusta kyseisten geenien signalointijärjestelmän aktivoitumiseen ja geenien ilmentymiseen LNCaP-solulinjassa reaaliaikaista käänteistranskriptio-pcr- (Q-RT-PCR) sekä ChIP-menetelmää käyttäen. 2 AINEISTO JA MENETELMÄT

6 3 2.1 Kliiniset näytteet Geenien ilmentymistä tutkittaessa käytettiin prostatektomialla poistetuista eturauhasista saatuja näytteitä, joista 27 on hoitamattomasta primaarisesta eturauhassyövästä (PC) ja kahdeksan hyvänlaatuisesta liikakasvuisesta eturauhasesta (BPH = benign prostate hyperplasia). Lisäksi työssä käytettiin virtsaputken kautta osittaisleikkauksella poistetuista eturauhasista (transuretharal resections of the prostate = TURP) saatuja näytteitä, joista seitsemän on BPH:sta ja 15:ta CRPC:stä. Tuoreet näytteet on jäädytetty nestemäisessä typessä, minkä jälkeen kokonais-rna on eristetty Trizol(TM)-Reagentilla (Invitrogen Inc, Carlsbad, California, USA) valmistajien ohjeiden mukaisesti. Näytteet sisältävät vähintään 70 % syöpäsoluja. Kliinisten näytteiden käyttö on hyväksytty Tampereen yliopistollisen sairaalan eettisessä komiteassa. 2.2 LNCaP-solulinjat ja soluviljely Tutkimuksessa käytettiin kolmea LNCaP-solulinjaa (ATCC, Manassas, VA, USA). Kontrollina toimiva LNCaP-pcDNA3.1-solulinja oli transfektoitu tyhjällä pcdna3.1-vektorilla (Invitrogen Inc., Carlsbad, CA, USA) ja LNCaP-ARmo- ja LNCaP ARhi solulinjat pcdna3.1-vektoriin istutetulla AR geenin cdna:lla. LNCaP-ARmo ilmentää 2 4-kertaisesti ja LNCaP ARhi 4 5- kertaisesti AR-proteiinia. AR:n ilmentymisaste on analysoitu käyttämällä Western Blottingmenetelmää. Transfektiossa käytettiin LipofectaminePlus-transfektioreagenssia (Invitrogen Inc.). AR:ää ilmentävien solulinjojen perustaminen on kuvattu tarkemmin Walteringin tutkimuksissa (Waltering ym 2009). Solut viljeltiin RPMI 1640 mediumissa (BioWhittaker Inc, South Logan, UT, USA), joka oli täydennetty 10 % nautasikiön seerumilla (fetal bovine serum = FBS) (Hyclone Inc, Shout Logan, UT, USA) ja 1 % glutamiinilla (BioWhittaker Inc.). Lisäksi käytettiin 250 µg/ml Genetisiiniä (Invitrogen Inc) transfektion stabiiliuden säilyttämiseksi. Soluja viljeltiin lämpökaapissa, jossa vallitsi +37 C lämpötila ja 5 % hiilidioksidipitoisuus. Kun solujen määrä saavutti % kasvutiheyden viljelyastian pohjasta, solut jaettiin tasaisesti neljään 75 m²:n viljelyastiaan. Solujen annettiin kasvaa vielä neljä päivää, jonka jälkeen osa solut erotettiin immunosaostus- ja geenien ilmentymiseen liittyviä tutkimuksia varten. Immunosaostusmenetelmää varten soluja inkuboitiin kaksi tuntia 1 tai 100 nm DHT:ssä (Steraloids, Newport, RI, USA) ja kontrollisolut käsiteltiin

7 4 etanolissa (EtOH). Geenien ilmentymisen tutkimista varten LNCaP-pcDNA3.1, -ARmo ja -ARhisolulinjoja inkuboitiin 0 nm, 1 nm sekä 100 nm DHT-konsentraatioissa 4 ja 24 tunnin ajan, minkä jälkeen solut kerättiin talteen. 2.3 Geenien transkriptiotuotteiden kääntäminen komplementtaariseksi DNA:ksi Geenien ilmentymistä tutkittaessa LNCaP-solujen mrna käännettiin käänteisellä transktiptio-pcrmenetelmällä (RT-PCR = Reverse transcription polymerase chain reaction) kestäväksi komplementtaariseksi DNA:ksi (cdna = complementar DNA). RNA eristettiin LNCaP-soluista Trizolilla (Invitrogen Inc) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Solut huuhdeltiin PBS:llä, minkä jälkeen soluja liuotettiin 5 ml:ssa Trizolia 75 ml pulloissa hetken aikaa. Solujen sekaan lisättiin 1 ml kloroformia. Soluja inkuboitiin 5 minuuttia huoneenlämmössä, minkä jälkeen niitä sentrifugoitiin g:n voimalla 10 minuutin ajan 2-8 C:ssa. Pinnalle jäänyt väritön RNA:ta sisältävä pintakerros pipetoitiin talteen. RNA:ta inkuboitiin 0,5 ml isopropanolissa 10 minuutin ajan huoneenlämmössä, minkä jälkeen soluja sentrifugoitiin 10 minuuttia 4 ºC:ssa. Pintakerroksen poistamisen jälkeen jäljelle jäänyt RNA pestiin 70 %:ssa RNaasi-puhtaasta vedestä valmistetulla etanolilla. RNA:ta sentrifugoitiin maksiminopeudella 10 minuuttia 4 ºC:ssa. RNA:ta liotettiin edestakaisella pipetointiliikkeellä 0,5 % SDS:ssä, minkä jälkeen sitä lämmitettiin 10 minuuttia 60 C:ssa. RNA:n puhtaus varmistettiin NanoDrop-laitteella. Mittauksessa käytettiin aallonpituutta 260/280. Näyte on sitä puhtaampi mitä lähempänä laitteella saatu arvo on lukua 2,0. RNA:n puhtaudeksi saatiin arvo 1,97 ja konsentraatioksi 1561 ng/µl. RNA:sta syntetisoitiin yksijuosteista cdna:ta AMV-käänteiskopioijalla (Finnzymes Inc, Espoo, Finland) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Synteesissä käytettiin 2,6 µl:aa LNCaP:sta eristettyä RNA:ta, 0,3 µl:aa satunnaisia heksameereja (Random Hexamer Primer, Fermentas Inc, Burlington, Ontario, Canada), 1 µl universaalia RNA:ta (Universal Reference Total RNA, Clontech) sekä 6,1 µl:aa vettä (Nuclease-Free Water, Qiagen, Hilden, Germany). Liuosta ajettiin RT-PCR:llä 10 minuuttia 70 ºC:ssa, minkä jälkeen lisättiin 2,5 µl:aa reaktiopuskuria (10x RobusT Reaction Buffer), 2,5 µl:aa dntp-seosta (dntp-mix), 0,5 µl:aa RNaasi inhibiittoria (RNase inhibitor), 0,5 µl:aa AMV:tä ja 9 µl:aa vettä (Nuclease-Free Water, Qiagen, Hilden, Germany). Tämän jälkeen ajoimme liuosta tunnin 42 C:ssa ja 10 minuuttia 70 C:ssa.

8 5 2.4 Reaaliaikainen Q-RT-PCR-menetelmä AR:n sitoutumista geenien säätelyalueille sekä sitoutumisen vaikutusta geenien ilmentymiseen selvitettiin reaaliaikaisella PCR-menetelmällä (Quantitative PCR = Q-PCR). Q-PCR-ajoissa käytettiin BioRad CFX96-ohjelmaa (Bio-Rad Laboratories Inc, Hercules, California, USA). Jokaista ajoa varten valmistettiin yleisliuos sekoittamalla tutkittavan geenin alukeparit vedellä (Nuclease-Free Water, Qiagen, Hilden, Germany) laimennettuun Maxima SYBR-Greeniin (Fermentas Inc, Burlington, Ontario, Canada) (Liite 4), jonka lisäksi Q-PCR-ajon tehokkuuden määrittämistä varten jokaiseen ajoon liitettiin mukaan standardisuora. 96-kuoppamaljalle annosteltiin 2 µl:aa jokaista näytettä sekä 2 µl:aa standardisuoran jokaista laimennosta, minkä jälkeen lisättiin näytteiden ja standardilaimennosten sekaan 20 µl:aa yleisliuosta. Seoksen sisältävä kuoppamalja suljettiin liimapintaisella kalvolla Q-PCR-ajoa varten. Q-PCR-ajossa templaatista monistuvan kaksijuosteisen DNA:n määrä mitattiin jokaisen polymerisaatiokierroksen jälkeen. Taustafluorenssin yläpuolelle kohoavaa eli havaittavissa olevaa Q-PCR-tuotteen antamaa flurenssitasoa kutsutaan kynnystasoksi. Kynnystason ylittyessä näytteiden monistuma on eksponentaalista. Kynnyskierros (Threshold cycle = Ct) tarkoittaa kynnystason saavuttamiseen vaadittavaa polymerisaatiokierrosten lukumäärää. Q-PCR-ajon aikana jokaiselle näytteelle saatiin Ct, joka on kääntäen verrannollinen näytteen alkuperäiseen konsentraatioon. Tutkittavien geenien ilmentymistä selvitettiin Q-RT-PCR-menetelmällä. Templaattina käytettiin LNCaP-solulinjoista valmistettuja näytteitä sekä kliinisiä näytteitä. Tutkittavien geenien alukkeet suunniteltiin Primer3 Programilla ( (Liite 5). LNCaP näytteitä varten valmistimme konsentraatioltaan tunnetun standardilinjan, jonka liitimme jokaiseen Q-RT-PCR-ajoon mukaan. Standardilinjan valmistamista varten LNCaP-soluja viljeltiin kaksi viikkoa, minkä jälkeen RNA eristettiin Trizolilla (Invitrogen Inc) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Yksijuosteisen cdna:n synteesi RNA:sta suoritettiin AMV-käänteiskopioijalla (Finnzymes Inc, Espoo, Finland) valmistajan ohjeiden mukaisesti. 10 µl:aa cdna:ta laimennettiin vedellä (Nuclease-Free Water, Qiagen, Hilden, Germany) 50 µl:ksi. Tästä ensimmäisestä standardista siirrettiin 10 μl:aa toiseen putkeen, joka laimennettiin 50 µl:ksi. Laimentamista jatkettiin samalla tavalla aina viimeisimmästä laimennoksesta, kunnes standardilinja käsitti kuusi laimennosta. Standardilinja vastasi 0,32 μl cdna:n laimentamista 5000, 1000, 200, 40, 8 ja 1,6 μl:ksi. Q-RT-PCR-ajon jälkeen saimme jokaiselle näytteelle Ct:n ja standardilinjan perusteella konsentraation suuruutta kuvaavan aloitusarvon (starting quantity = SQ). Analyysia varten

9 6 suoritimme qpcr-ajon tutkittavien geenien lisäksi transkriptioltaan vakaalla TPB-geenillä, jonka ilmentymistä tarvitaan jatkuvasti solun yleisessä toiminnassa. DHT:llä inkuboimattomien näytteiden geenien ilmentymistä ja TPB:n SQ-arvojen osamäärää verrattiin DHT:lla inkuboitujen näytteiden SQ-arvoon. 2.5 Kromatiinin immunosaostus AR:n sitoutumiskohtien Q-PCR-tutkimusta varten tehtiin kromatiini-immunosaostus (Chromatin Immunoprecipitation = ChIP). Solut kiinnitettiin 1 % formaldehydillä (Merck, KgaA, Darmstadt, Germany) rauhallisesti sekoittaen huoneenlämmössä 10 minuutin ajan. Tämän jälkeen jäisessä astiassa pidettäviä soluja huuhdeltiin kahdesti jääkylmällä PBS:llä (BioWhittaker). PBS huuhdeltiin pois ja solut kerättiin putkiin, jotka sisälsivät 1,5 ml PBS:ää 2 x Complete Protease Inhibitorilla täydennettynä (Roche Inc, Mannheim, Germany). Soluja sentrifugoitiin 1200 g:llä 5 minuuttia +4 C lämpötilassa, minkä jälkeen PBS kaadettiin pois. 420 µl:aa liuotuspuskuria (Liite 1) lisättiin pelletteihin ja inkuboitiiin 20 minuuttia jäisessä astiassa. Sonikaatio suoritettiin Bioruptorilla (Diagenode Inc, Sparta, NJ, USA) kahdessa 15 minuutin erässä. Sonikaatiolla pyrittiin saamaan emäsparin (bp = base pair) suuruisia fragmentteja. Amplitudin tiheys oli suurimmillaan 20 khz ja teho 200 W. Jokainen näyte jaettiin puoliksi, ja 210 µl:n näytteet pipetoitiin 5 ml suuruisiin putkiin. Sonikaation aikana näytteitä säilytettiin jäisessä astiassa. Sonikoidut näytteet kerättiin yhteen ja sentrifugoitiin g:llä 20 minuuttia +4 C:ssa. Jokainen näyte jaettiin sen jälkeen neljään 100 µl:n suuruiseen osaan. Jokaiseen erään lisättiin 900 μl:aa laimennospuskuria (Liite 1), minkä jälkeen näytteistä otettiin talteen 20 µl kromatiinifragmenttien suuruuden tarkastamista varten. Analysointia häiritsevää taustaa vähennettiin inkuboimalla näytteitä yhden tunnin ajan +4 C:ssa rauhallisesti sekoittaen. Inkuboinnissa käytettiin 100 µg:aa hiivan trna:ta (invirtogen Inc) ja 20 µl:aa jäniksen seerumia (Santa Cruz biotechnology Inc, Santa Cruz, CA, USA). Sen jälkeen näytteisiin lisättiin 45 µl:aa 50 %:ta Gammabind Protein G Sepharose-massaa (GE Healthcare, UK), jossa näytteet inkuboitiin yhden tunnin ajan rauhallisesti sekoittaen +4 C:ssa. Näytteitä sentrifugoitiin 3300 g:llä kolme minuuttia +4 C:ssa, minkä jälkeen pinnalle jäänyt nestekerros siirrettiin toiseen eppendorfiin. Jokaisesta näytteestä kerättiin 10 %, eli 100 µl:aa, input-näytteeksi. Input-näytteet laimennettiin veteen 1:10.

10 7 Jäljelle jääneeseen näytteeseen (IP näyte) lisättiin vasta-aineita (Liite 2), joita inkuboitiin 12 tunnin ajan rauhallisesti seikoittaen +4 C:ssa. Immunosaostus suoritettiin lisäämällä 60 µl 50 %:sta Gammabind Protein G Sepharose-massaa. Näytteitä inkuboitiin neljän tunnin ajan rauhallisesti sekoittaen +4 C:ssa. Näytteitä huuhdeltiin vuorotellen TSE I- ja TSE III-puskureilla sekä IIIpuskurilla 10 minuuttia (Liite 1). Tämän jälkeen näytteet huuhdeltiin vielä kahdesti TSE I- puskurilla (Liite 1). Jokaisen pesukerran jälkeen näytteet sentrifugoitiin 3300 g voimakkuudella 3 minuutin ajan +4 C:ssa, minkä jälkeen pinnalle jäänyt nestekerros pystyttiin poistamaan. Näytteitä inkuboitiin kahdesti 20 minuuttia eluaatiopuskurilla +37 C:ssa sekoittaen voimakkaasti vortexilla. Input-näytteisiin lisättiin 5 µl:aa SDS:ää ja 11,5 µl:aa NaHCO3:a, jotta olosuhteet olisivat samat kuin IP-näytteillä. IP- ja input-näytteet inkuboitiin 12 tuntia +65 C:ssä kuivassa ympäristössä proteiinien ja DNA:n välisten ristikkäislinkkien kääntämiseksi. Näytteet puhdistettiin PCR-puhdistuskitillä (QIAquik PCR purification kit, Qiagen, Hilden, Germany) valmistajan ohjeiden mukaisesti (Liite 3). Sonikaation onnistuminen varmistettiin tutkimalla jokaisesta näytteestä aikaisemmin otettu 20 µl:n kromatiininäyte. Näytteeseen lisättiin 80 µl:aa TSE I puskuria, minkä jälkeen DNA:n ristikkäissidokset purettiin inkuboimalla näytteitä 12 tuntia +65 C:ssa, minkä jälkeen DNA puhdistettiin PCR-puhdistuskitillä. 5, 10 ja 15 µl:n kokoiset näytteet ajettiin 1,5 % agaroosigeelissä fragmenttien suuruuden määrittämiseksi. AR:n kromatiiniin tarttumista tutkittiin Q-PCR-menetelmällä, jossa templaatteina käytettiin Inputja IP-kromatiininäytteitä. Q-PCR-ajoa varten valmistettiin standardilinja 100 nm DHT:ssä inkuboidusta LNCaP-solulinjan IP-näytteestä. 5 µl:aa näytettä laimennettiin vedellä (Nuclease-Free Water, Qiagen, Hilden, Germany) 50 µl:ksi. Tästä ensimmäisestä standardista otettiin edelleen 5 μl:aa toiseen putkeen ja laimennettiin 50 µl:ksi. Laimentamista jatkettiin samalla tavalla aina viimeisimmästä laimennoksesta, kunnes standardilinja käsitti viisi laimennosta. Standardilinja vastasi 1 μl näytteen laimentamista , , 1 000, 100 ja 10 μl:ksi. Alukkeet (Liite 5) suunniteltiin Yu ym. (2010) tuottaman yleisesti saatavilla olevaan ARBS-tiedoston perusteella. Käytimme ARBS:ien alukkeiden suunnittelussa IGB-sivustoa (Integrated Genom Browser), UCSC:n kotisivuja ( sekä Primer3-ohjelmaa ( Lisäksi varmistimme NBCI-sivustoilta, etteivät alukkeet sopineet epäspesifisiin kohtiin genomissa. IP-näytteiden (ChIP) suhteellinen rikastuma Input-kromatiininäytteisiin laskettiin Ct-menetelmän

11 8 kaavalla 2 Ct, jossa ΔCt = Ct (ChIP-templaatti) Ct (input). Tarkastimme AR:n säätelyalueelle tarttumisen spesifisyyden. Lisäsimme jokaiseen ajoon mukaan näytteen, Lisäksi tarkastimme AR:n kromatiiniin tarttumisen spesifisyyden IgG:llä. Jokaisessa ajossa käytettiin kontrollina LNCaP- ARhi- ja pcdna1.3-näytteitä, joiden immunosaostuksessa oli käytetty epäspesifistä jäniksen IgG:tä. Jokaiseen Q-PCR-ajoon liitettiin mukaan epäspesifisellä jäniksen IgG:llä valmistettu immunosaostusnäyte. 2.6 Sulamiskäyräanalyysi ja agaroosigeeliajo Q-PCR-ajon jälkeen varmistimme sulamiskäyräanalyysin ja agaroosigeeliajon avulla, että olimme monistaneet oikeaa tuotetta. Sulamiskäyräanalyysissä PCR-tuotetta lämmitettiin 50 C:sta 95 C:seen, jolloin fluoresenssin vähentyessä epäspesifiset tuotteet erottuivat. 1,0 % agaroosigeeli valmistettiin sekoittamalla 0,6 mg agaroosia (SeaKem LE Agarose, CAMREX, Rockland Inc, ME, USA) 60 ml:aan 1:10 vedellä laimennettua TBA:ta, joka sisälsi 1 ml:n etydiumbromidia. Geelikuoppiin pipetoitiin 5 µl:aa jokaista näytettä. Näytteiden sekaan pipetoitiin 1 µl:n DNAloading Dyetä (GelPilot Loading Dye, 5x, QIAGEN, Hilden, Germany), joka esti näytteiden poisleviämisen kuopista. Lisäksi näytteiden rinnalle pipetoitiin DNA-markkeri (GeneRuler, 100 bp DNA Ladder, bp), joka sisältää kooltaan tunnettuja partikkeleita. Näytteitä ajettiin agaroosigeelissä 150 V:n jännitteellä 45 minuuttia. Ajon jälkeen vertasimme UV-valossa, minkä kokoisen DNA-partikkelin vieressä monistettu Q-PCR-tuote sijaitsi. Geenien transkriptiotuotteiden koko oli bp ja säätelyalueiden bp. 3 TULOKSET Urbanucci ym. (2011) on julkaissut luettelon geeneistä, jotka mahdollisesti vaikuttavat CRPC:n kehittymiseen. Julkaisun perusteella tähän tutkimukseen valittiin geenit DTL (denticleless/raregulated nuclear matrix associated protein) ja TPX2 (microtubule-associated, homolog). DTL ja TPX2 ilmentyvät merkittävästi CRPC:tä verrattaessa PC:n sekä BPH:n vähintään yhdessä aikaisemmassa kliinisiin näytteisiin perustuvassa geenien ilmentymisen array-analyysissä (Liite 6). Lisäksi tutkimukseen valittiin BUB1B, koska sillä ei Urbanucci ym. (2011) mukaan ollut ARBS:ia 250 kb:n etäisyydellä promoottorista, mutta siitä huolimatta se ilmentyi 4 tunnin DHT-inkubaation jälkeen yli 1,5-kertaisesti. ONCOMINE:stä ( saatavilla olevien tutkimusten

12 9 mukaan BUB1B ja DTL ilmentyivät merkittävästi CRPC:ssä PC:n verrattuna (Liite 7). Lisäksi tutkimukseen valittiin funktionaalisesti kiinnostava PVT (PVT1 oncogene - non-protein coding), joka AR:n sitoutumisesta huolimatta ei ollut AR:n säätelemä (Urbanucci ym. 2011, Waltering ym. 2009). 3.1 Geenien ilmentyminen solulinjoissa TPX2:n, BUB1B:n, PVT:n ja DTL:n ilmentymistä LNCaP-solulinjoissa tutkittiin inkuboimalla soluja 4 tai 24 tuntia DHT:ssä tai etanolissa (0 M), minkä jälkeen geenien ilmentyminen mitattiin Q-RT-PCR-menetelmällä. Tutkittavien geenien lisäksi mitattiin myös DHT:n määrästä ja inkubaatioajasta riippumattoman TPB ilmentyminen. DHT-konsentraatioltaan ja inkubaatioajaltaan erilaisten näytteiden SQ-arvo jaettiin TPB:n vastaavien näytteiden arvoilla. TPB:n suhteen saadut arvot normalisoitiin etanolilla inkuboitujen näytteiden SQ-arvolla. BUB1B ilmentyy neljän tunnin inkubaation jälkeen huomattavan voimakkaasti ARmo-soluissa, joissa ilmentyminen on voimakkainta 0,1 nm DHT:ssa ja vähäisintä 100 nm DHT:ssa. 24 tunnin kohdalla BUB1B ilmentyy kuitenkin ARmo-soluissa muita solulinjoja heikommin. BUB1B:n ilmentyminen on voimakkainta 24 tunnin kohdalla LNCaP-ARhi-soluissa. ARhi-soluissa BUB1B ilmentyy parhaiten 10 nm DHT:ssa ja vähiten 100 nm DHT:ssa. DHT-konsentraation kasvaessa BUB1B:n erot solulinjojen välillä tasoittuvat molemmissa aikapisteissä. TPX2:n ilmentyminen on 0,1 nm DHT:ssa voimakkaampaa LNCaP-ARhi- kuin LNCaP-pcDNA3.1-soluissa. DHTkonsentraation voimistuessa TPX2:n ilmentyminen tasoittuu solulinjojen välillä. Voimakkainta TPX2:n ilmentyminen on 1 nm:ssa DHT:ssä 24 tunnin inkubaation jälkeen. DTL ilmentyy tasaisesti kaikissa solulinjoissa 4 tunnin DHT-inkubaation jälkeen. Solulinjojen välisiä eroja ilmenee 24 tunnin inkubaation jälkeen, jolloin matalassa konsentraatiossa ilmentyminen on voimakkainta LNCaP-ARhi-soluissa ja 100 nm:ssa DHT:ssä LNCaP-pcDNA3.1- soluissa. 24 tunnin jälkeen TPX2 ja DTL ilmentyminen oli vähäisintä ARmo-soluissa. PVT1:n ilmentymisessä ei ollut solulinjojen välillä eroa 24 tunnin jälkeen, mutta 4 tunnin PVT1 ilmentyi muihin solulinjoihin verrattuna kaksi kertaa voimakkaammin 0,1 nm DHT:ssa ARhi-soluissa ja 100 nm:ssa DHT:ssä pcdna3.1-soluissa.

13 10 4 BUB1B 5 TPX2 LNCaP-pcDNA3.1 LNCaP-ARmo LNCaP-ARhi M 0.1nM 1nM 10nM 100nM 0M 4 h 24 h 0.1nM 1nM 10nM 100nM 1 0 0M 0.1nM 1nM 10nM 100nM 0M 4 h 24 h 0.1nM 1nM 10nM 100nM DTL PVT M 0.1nM 1nM 10nM 100nM 0M 4 h 24 h 0.1nM 1nM 10nM 100nM 0.0 0M 0.1nM 1nM 10nM 100nM 0M 4 h 24 h 0.1nM 1nM 10nM 100nM Kuva 1: AR:n yli-ilmentymisen vaikutus sen kohdegeenien ilmentymiseen LNCaP-solulinjoissa. Q- RT-PCR-menetelmään perustuva 4 tai 24 tuntia DHT:llä inkuboitujen solujen geenien ilmentymistä kuvaava SQ-arvo, joka on normalisoitu etanolilla inkuboitujen näytteiden SQ-arvolla. Geenit ovat vertailukelpoisia toisiinsa nähden, sillä näytteet on suhteutettu vakaasti ilmentyvään TPB:hen. 3.2 AR:n tarttuminen mahdollisiin säätelyalueisiin Aikaisemmissa tutkimuksissa (Urbanucci ym. 2011, Yu ym. 2010) on löydetty ChIP-seqmenetelmällä TPX2:n, BUB1B:n ja DTL:n ilmentymiseen mahdollisesti liittyviä ARBS:ja, joiden olemassaolo vahvistettiin tässä tutkimuksessa ChIP-Q-PCR-menetelmällä. AR:n tarttuminen säätelyalueille esitetään normalisoituina arvoina, jolloin pystytään vertailemaan matalassa DHTkonsentraatiossa inkuboitujen LNCaP-ARhi- ja -pcdna3.1-solujen eroa etanolissa inkuboituihin soluihin. AR:n kromatiiniin tarttuminen on spesifistä, jos IgG:llä leimatuissa näytteissä ilmenee vähemmän tutkittavaa säätelyaluetta kuin AR-vasta-aineella leimatuissa immunosaostusnäytteissä.

14 11 AR ei sitoudu BUB1B:n promoottorialueelle LNCaP-pcDNA3.1 eikä -ARhi-soluissa. AR:n sitoutuminen BUB1B:n +230-säätelyalueelle ARhi-soluissa on epäspesifistä. AR sitoutuu TPX2:n 70-säätelyalueeseen kolmenkertaisesti LNCaP-ARhi-soluissa, mutta vähäisesti LNCaPpcDNA3.1-soluissa. AR tarttuu TPX2:n +200-säätelyalueeseen seitsemänkertaisesti LNCaP-ARhisoluissa sekä kaksinkertaisesti LNCaP-pcDNA3.1-soluissa. DTL:n säätelyalueisiin AR tarttuu 10- kertaisesti LNCaP-ARhi-soluissa. LNCaP-pcDNA3.1-soluissa AR tarttuu viisinkertaisesti DTL:n +100-säätelyalueeseen, mutta ei tartu ollenkaan DTL:n 31-säätelyalueeseen. BUB1B 0 TPX2-70 DTL IgG ethanol 1nM DHT LNCaP-pcDNA3.1 IgG ethanol 1nM DHT LNCaP-ARhi 0 IgG ethanol 1nM DHT LNCaP-pcDNA3.1 IgG ethanol 1nM DHT LNCaP-ARhi 0 IgG ethanol 1nM DHT LNCaP-pcDNA3.1 IgG ethanol 1nM DHT LNCaP-ARhi BUB1B +230 TPX DTL IgG ethanol 1nM DHT LNCaP-pcDNA3.1 IgG ethanol 1nM DHT LNCaP-ARhi 0 IgG ethanol 1nM DHT LNCaP-pcDNA3.1 IgG ethanol 1nM DHT LNCaP-ARhi 0 IgG ethanol 1nM DHT LNCaP-pcDNA3.1 IgG ethanol 1nM DHT LNCaP-ARhi Kuva 2: AR:n tarttuminen BUB1B:n, TPX2:n ja DTL:n putatiivisiin säätelyalueisiin. AR:n sitoutuminen 1 nm DHT:llä inkuboituihin LNCaP-ARhi sekä -pcdna3.1-soluihin suhteessa etanolilla käsiteltyihin solulinjoihin. IgG sitoutuminen kromatiiniin kertoo tarttuneen AR:n spesifisyydestä.

15 BUB1B vs TBP TPX2 vs TBP DTL vs TBP Geenien ilmentyminen kliinisissä näytteissä Lopuksi geenien ilmentymistä verrattiin BPH-, PC- ja CRPC- näytteiden välillä. Jokaisen geenin ilmentyminen näytejoukkojen välillä analysoitiin Kruskal-Wallis-testillä. Kliinisistä näytteistä suoritettiin Q-RT-PCR:llä myös TPB:n ilmentyminen. Q-RT-PCR-menetelmällä saadut geenien ilmentymistä kuvaavat SQ-arvot jaettiin transkriptioihin yleisesti osallistuvan TBP:n (TATA box binding protein) SQ-arvolla, jolloin geenien ilmentymistä pystyttiin vertaamaan suoraan toisiinsa. BUB1B, DTL ja TPX2 ilmenivät merkittävästi CRPC:tä PC:n verratessa. BUB1B:n ja TPX2:n ilmetyminen oli hyvin merkittävää myös CRPC:tä BPH:hen verratessa. p < p < p < BUB1B TPX2 DTL * ** *** ns *** *** ns * *** BPH PCa CRPC 0.0 BPH PCa CRPC 0.00 BPH PCa CRPC Kuva 3: AR:n kohdegeenien ilmentyminen kliinisissä näytteissä Kruskall Wallis-testillä analysoituna (*** = 0.001; * = 0.01 to 0.05; NS = ei merkitsevä). Keskinäisen vertailun mahdollistamiseksi Q-RT-PCR-menetelmään perustuvan jokaisen geenin ilmentymistä kuvaava SQ-arvo on suhteutettu TPB:n SQ-arvoon. 4 POHDINTA PC:n hoidossa tapahtuvat hormonaaliset muutokset vaikuttavat CRPC:n kehittymiseen lisäämällä syöpäsoluja ja niiden ominaisuuksia toistaiseksi tuntemattomilla mekanismeilla. CRPC:hen ei ole olemassa elinaikaa merkittävästi pidentävää hoitoa. AR:n sekä sen säätelemien geenien ilmentyminen lisääntyy CRPC:ssä (Stanbrough ym. 2006). Yli-ilmentyvän AR:n säätelyn alla

16 13 olevien geenien tunnistaminen on tärkeää, jotta voidaan kehittää CRPC:n kehittymistä estäviä lääkkeitä sekä syöpävaiheen tunnistamista helpottavia merkkiaineita. Syövät ovat yleensä geneettisten muutosten vuoksi lääkekehittelyn kannalta haasteellisia, mutta eturauhassyövän myöhäisessä vaiheessa saman potilaan eri etäpesäkkeet ovat geneettisesti yllättävän samankaltaisia (Liu ym. 2009). Tässä työssä tutkittavat geenit on valittu tutkimuksesta (Urbanucci ym. 2011), jossa oli koottu yhteen CRPC:n kehittymiseen liittyviä geenejä. Tutkimuksesta poistettiin geenit, joiden säätelyalue sijaitsi samanaikaisesti 100 nm:ssa DHT:ssä LNCaP-PcDNA1.3-soluissa. Tutkimuksessa osoitettiin, että DTL:llä ja TPX2:lla on merkitystä CRPC:n kehittymisessä. DTL:n ja TPX2:n ilmentyminen poikkeaa merkitsevästi CRPC- ja PC-näytteiden välillä. BUB1B:n sekä TPX2:n ilmentyminen poikkeaa merkittävästi lisäksi BHP- ja CRPC-näytteiden välillä. Näiden tulosten perusteella vaikuttaa siltä, että DTL alkaa toimia poikkeavasti PC:n hoitoon liittyvän kastraation myötä, mutta BUB1B ja TPX2:n toiminta häiriintyy jo varhaisemmassa vaiheessa aiheuttaen PC:n kehittymisen. Toisaalta varmuudella ei tiedetä, ovatko PC-näytteiden luovuttajat ehtineet käyttää hormonihoitoa ennen eturauhasen poistattamista. Tämän perusteella voidaan päätellä, että TPX2:lla ja BUB1B:lla on merkitystä yleisesti eturauhasen patologisissa muutoksissa, mutta DTL osallistuu CRPC:n kehittymiseen. Lisäksi työssä tutkittiin mekanismeja, jotka voisivat selittää geenien lisääntynyttä ilmentymistä CRPC-näytteissä. Androgeeneillä on kaksitahoinen vaikutus LNCaP-solujen kasvuun, jolloin korkeat androgeenipitoisuudet vähentävät solujakautumista, mutta matala pitoisuus stimuloi kasvua (Kokontis ym. 1994). Aikaisemmissa tutkimuksissa on havaittu, että LNCaP-ARhi- ja ARmosoluissa ilmentyy huomattavasti enemmän geenejä LNCaP-pcDNA-soluihin verrattuna, jonka lisäksi LNCaP-solut kasvavat nopeammin matalassa DHT-konsentraatiossa (Waltering ym. 2009). Lisäksi Urbanucci ym. (2011) on osoittanut, että ARBS:eja sijaitsee 1 nm:n konsentraatiossa enemmän LNCaP-ARhi ja ARmo-soluissa kuin kontrollisoluissa. TPX2, DTL ja BUB1B ilmentyivät matalassa DHT-konsentraatiossa ARhi-soluissa voimakkaammin kuin pcdna3.1- soluissa. Vahvassa DHT-konsentraatiossa geenit ilmentyivät pcdna3.1-soluissa voimakkaammin kuin LNCaP-ARhi-soluissa. Geenien poikkeava ilmentyminen pcdna3.1- ja ARhi-solujen välillä korostui inkubaatioajan pidentyessä. Neljän tunnin aikapisteessä geenien ilmentymisellä ei ollut eroa, mutta 24 tunnin jälkeen erot solulinjojen välillä eri konsentraatioissa korostuivat. Tästä voidaan päätellä, että DHT-konsentraation ja AR-reseptorin määrällä on vaikutusta TPX2:n, BUB1B:n ja DTL:n ilmentymisen voimistumiseen.

17 14 Aikaisemmissa tutkimuksissa on viitteitä siitä, että AR-reseptorin määrä kasvaa PC:n kehittyessä CRPC:ksi (Chen 2004, Hara 2003), jolloin AR-määrän muuttuminen indusoi vuorollaan eri geeniryhmiä. Lipidisynteesiin liittyvien geenien ilmentyminen lisääntyy kohtalaisen AR-määrän lisääntymisen myötä (LNCaP-ARmo) (Swinnen ym. 2004) ja solunjakautumiseen liittyvät geenit ilmentyvät suurissa AR-määrissä (LNCaP-ARhi) (Latil ym. 2001, Linja ym. 2001, Waltering ym. 2009). Erityisesti DNA-aineenvaihduntaan, solusykliin, solujen organisointiin ja biogeneesiin sekä solujen sisäiseen signalointiin liittyvät geenit ovat LNCaP-ARhi-soluissa erityisen säädeltyjä jo 1 nm:ssa DHT-konsentraatiossa (Waltering ym. 2009). Jos androgeeniexpressio lisääntyy asteittain CRPC:n edetessä, tässä tutkimuksessa tutkitut geenit merkitsevät ennen kaikkea loppuvaiheen CRPC:ssä. TBX2, BUB1B ja DTL ovat solunjakautumiseen liittyviä geenejä ja ilmentyivät vuorokauden inkubaation jälkeen hallitsevasti ARhi-soluissa. BUB1B ilmentyi neljän tunnin DHTinkubaation kohdalla voimakkaasti myös ARmo-soluissa, mikä saattaa johtua geenien toisistaan poikkeavista ominaisuuksista. DTL ilmentyy voimakkaammin ARhi-soluissa kuin ARmo-soluissa, mikä saattaa viitata CRPC:n etenemisen myötä voimistuvaan ilmentymiseen, jolloin sillä olisi merkitystä lääkekehittelyssä metastoitunutta syöpää kohtaan. Näin ollen, tässä tutkimuksessa vahvistetaan aikaisemmat havainnot siitä, että AR:llä saattaa olla CRPC:n indusoimisen lisäksi vaikutusta syövän ominaisuuksiin. AR:n tarttumisen lujuus säätelyalueille on määritelty genomin kattavasti 0 nm, 1nM sekä 100 nm DHT:ssa LNCaP-pcDNA3.1, -ARmo ja -ARhi-solulinjoissa ChIP-sekvensoinnin ja Q-RT-PCR:n avulla (Urbanucci ym. 2011). LNCaP-ARhi-solujen suuri AR-proteiinin määrä lisäsi AR:n sitoutumista kromatiiniin TPX2 ja DTL:n promoottorien läheisyydessä verrattuna LNCaPpcDNA3.1-soluihin. AR:n sitoutuminen BUB1B:n säätelyalueille oli heikkoa, mikä vahvisti aikaisempia havaintoja (Urbanucci ym. 2011). Tämä tutkimus vahvistaa aikaisempia havaintoja siitä, että AR:n tarttuminen kromatiiniin on 1 nm:ssa DHT:ssa LNCaP-ARhi-soluissa vahvempaa kuin pcdna3.1-soluissa, koska AR:n yli-ilmentyminen herkistää reseptoria tarttumaan geenien säätelyalueille. Lisäksi vahvistettiin tutkittavien geenien osalta ChIP-sekvensoinnin tulokset (Urbanucci ym. 2011), joiden mukaan suuri AR-määrä lisää matalassa DHT:ssä AR:n sitoutumista DTL:n ja TPX2:n säätelyalueisiin, mutta ei kuitenkaan lisää tarttumista BUB1B:n säätelyalueisiin. Tutkimuksessa ei kuitenkaan vahvistettu Urbanuccin ym. (2011) ARBS:ien sijainteja, sillä tässä työssä käytetyt alukkeet suunniteltiin Yu:n tutkimusryhmän (Yu ym. 2010) aineiston perusteella. BUB1B:n ilmentyi merkittävästi kliinisissä syöpänäytteissä sekä matalassa DHT:ssa LNCaP-ARhisoluissa, vaikka AR:n sitoutuminen sen säätelyalueille ei lisääntynyt. Tästä voidaan päätellä, että BUB1B:n ilmentyminen lisääntyy solunjakautumisen yhteydessä epäsuoran mekanismin välityksellä. Lisätutkimuksilla voidaan selvittää AR:n vaikutusmekanismi BUB1B:n aktivoimisessa.

18 15 Lisäksi tulisi tutkia AR:n aktivointimekanismeja TPX2:n ja DTL:n säätelyssä, sekä säätelyaluille sitoutuvien tekijöiden asetylisaatiostatusta. Lisäksi vahvistimme aikaisempien tutkimusten (Waltering ym. 2009, Urbanucci ym. 2011) tulokset, joiden mukaan AR säätelee heikosti PVT1:tä. Koska tässä työssä tutkittiin nimenomaan AR:n säätelemiä geenejä, ei ollut syytä tutkia AR:n tarttumista PVT1:n säätelyalueille eikä PVT1:n ilmentymistä kliinisissä näytteissä. Mielenkiintoista kuitenkin on PVT1:n heikko aktivoituminen ARhi-soluissa matalassa ja pcdna3.1-soluissa korkeassa DHT:ssa. Lisää tutkimuksia tarvitaan, jotta voidaan selvittää aiheuttaako PVT:n vähäinen aktivoituminen muutoksia PC:ssä. Lisätutkimusten yhteydessä voitaisiin myös selvittää PVT1:n ilmentyminen kliinisissä näytteissä. Aikaisempien tutkimusten mukaan tässä tutkimuksessa tutkitut geenit liittyvät syöpään. DTL koodaa proteiinia, jolla on merkittävä rooli DNA-synteesissä, solukierrossa, sytokineesissä, solun jakautumisessa ja erilaistumisessa (Pan ym. 2006). Lisäksi on viitteitä siitä, että DTL saattaa säädellä p53 proteiinia (Banks ym. 2006) ja DNA:n vahingoittamattomuudesta vastuussa olevaa DT1 proteolyysiä (Higa ym. 2006) sekä saattaa olla välttämätön varhaisessa G2-M tarkastuspisteessä (Sansam ym. 2006). DTL:n kokeellinen toiminnan rajoittaminen aiheuttaa G2-Mvaiheessa olevien solujen kasaantumista, mikä rajoittaa syövän kasvua (Ueki ym. 2008). DTLgeenillä on osoitettu olevan merkittävä rooli rintasyöpäsolujen kasvussa (Aaltonen ym. 2006). TPX2 ja BUB1B liittyvät mitoottisen solunjakautumisen M-vaiheen säätelyyn. TPX2 koodaa tumasukkulan keskeistä proteiinia ja BUB1B koodaa entsyymiä, joka on mukana solunjakautumisen anafaasivaiheen tarkastuspisteessä. Tutkittaessa geenien toimintaa hiiren eturauhasen siirtogeenisessä adenokarsinooman PC:ssä on havaittu geenien myöhäistä ilmentymistä tuumori ja metastoituneissa näytteissä, mikä viittaa myöhäisessä vaiheessa tapahtuvaan säännöstelyn purkamiseen. BUB1B kertoo PC:n huonosta ennusteesta (Kela ym. 2009). Poikkeuksellisesti toimivan BUB1B:n on todettu olevan tärkeä tekijä PC:n muodostumisessa, mikä on vahvistanut mitoottista solujakautumista säätelevien geenien (mitotic spindle checkpoint = MSC) olevan yhteydessä syövän kehittymiseen (Carver ym. 2009). Lisäksi kolorektaalisissa syövissä on raportoitu löytyneen somaattisten solujen mutaatioita mitoosin aikana kromosomien erottelemiseen osallistuvissa geeneissä, jolloin yksikin mutaatio BUB1B-geenissä voi aiheuttaa ressessiivisesti autosomaalisesti periytyvän altistuksen mahalaukkuun ja suolistoon liittyvään syöpään (Rio Frio ym. 2010). PVT1 on proteiinia koodamaton RNA-kompleksi, jolla MYC:n aktivaattorina on tutkimusten mukaan merkittävä rooli rintasyövän ja paksusuolensyövän patogeneesissä (Guan ym. 2007, Pomerantz ym. 2009).

19 16 Geenien ilmentymisen voimakkuus saattaa vaihdella ajallisesti, jolloin tulos on erilainen eri aikapisteissä. Näytteiden toisistaan poikkeavat DHT:n inkubaatioajat sekä konsentraatiot saattavat aiheuttaa virheitä tulosten tulkinnassa. Suurin osa tuumoreista ilmentää villityypin AR:ää hormonihoidosta huolimatta. Flutamidilla hoidetuilta potilailta on löydetty paljon AR-mutaatioita (Balk SP 2002), jotka aktivoituvat flutamiidin metaboliitin vaikutuksesta. Parhaiten tunnettu mutaatio LNCaP-solulinjassa on T877A, jota löydetään jatkuvasti flutamiinilla hoidetuista potilaista (Balk SP 2002). Nämä mutaatiot ovat merkittäviä tekijöitä flutamiinihoidon epäonnistumisessa. Epäspesifisen aktivaation mahdollisuus minimoitiin tässä työssä transfektoimalla villityypin AR:n cdna LNCaP-soluihin. Mutantoituneen AR:n vaikutusta ei pystytä täysin poistamaan, mutta LNCaP-ARmo- sekä LNCaP-ARhi-soluissa suurin osa AR:stä on villityyppiä. Virheiden vähentämiseksi käytettiin lisäksi luonnollista ligandia kahdessa aikapisteessä neljässä konsentraatiossa. ChIP-seq-menetelmällä tuotettu ARBS-aineisto vastaa perinteisen ChIP-Q-PCR-menetelmän tuloksia PSA:n ja TMPRSS2:n säätelyalueista (Urbanucci ym. 2011). Yli-ilmentyvän AR:n yhteys ARBS:ien määrään on varmistettu 10-kertaisesti AR:ää ilmentävällä LuCaP69- sekä monistumaa ilmentämättömällä LuCaP70-vieraslajisiirteellä (Chen ym. 2004, Urbanucci ym. 2011). ARBS:ien sijainnit kuitenkin vaihtelevat merkittävästi kudosnäytteiden ja solulinjojen välillä. Vieraslajisiirteiden ja LNCaP-solulinjan ARBS:ien huono vastaavuus toisiinsa saattaa johtua soluviljelyn ja hiirimallin erilaisesta kasvuympäristöstä, mikä voi johtua solujen geneettisistä eroavaisuuksista AR:n kromatiiniin tarttumiseen liittyvien transkriptiotekijöiden kesken. Vieraslajisiirteiden ja LNCaP-mallin ARBS:it sijaitsevat kuitenkin lähellä toisiaan. Lisäksi androgeenisäädellyillä geeneillä saattaa olla olemassa monia ARBS:eja. ChIP-menetelmän luotettavuus on kiinni vasta-aineiden spesifisyydestä. AR:n ei tartu PSA:n säätely- ja promoottorialueiden väliin, mutta epäspesifiset vasta-aineet saattavat valikoida mukaan myös näitä alueita. AR:n spesifisyys on tarkastettu Urbanucci ym. (2011) tutkimuksessa ChIP-Q- RT-PCR-mentelmällä. AR:n kromatiiniin tarttuminen ChIP-työssä oli spesifistä, sillä immunosaostusnäytteiden kontrollialueeseen sitoutui vähemmän AR:ää kuin epäspesifistä jäniksen IgG:tä. ChIP-menetelmässä on monta vaihetta, mikä altistaa virheille ja aiheuttaa vaihtelua tuloksissa. Solujen keräysvaiheessa saatetaan menettää soluja, minkä vuoksi immunosaostukseen sopivan kromatiinin määrä vähenee. Lisäksi usean näytteen sonikaatiovaihe kestää useita tunteja, mikä saattaa aiheuttaa muutoksia lopputuloksissa. Q-RT-PCR-menetelmää varten suunnittelimme tutkittavan templaatin kopiointiin sopivat alukkeet.

20 17 Alukeparit liittyvät parhaiten näytteeseen niille ominaisessa lämpötilassa, joka riippuu alukkeiden emästyypeistä ja alukkeen pituudesta. Q-RT-PCR olosuhteet optimoitiin jokaiselle alukeparille sopiviksi standardisuoraa käyttäen. Ajoimme alukeparien standardikäyrän vähintään kahdessa eri lämpötilassa. Optimoinnissa käyttämämme lämpötilat olivat mahdollisimman lähellä alukkeiden suunnittelussa käyttämämme ohjelman (Primer3 Input, version 0.4.0) antamia laskennallisia sulamislämpötiloja (Tm). Alukkeiden sulamislämpötilojen välinen ero oli enintään 1,0 C. Q-RT- PCR-ohjelmiston muodostaman standardisuoran ja sulamiskäyrän perusteella valitsimme alukkeiden liittymisvaiheelle sopivimman lämpötilan. Standardisuoran avulla määrittelimme reaktion suorituskyvyn, joka on parhaimmillaan lähestyttäessä 100 %:n tehokkuutta. Geenien ilmentymisen tutkimista varten alukkeet suunniteltiin yhdistämään kaksi eksonia, jolloin ne sitoutuivat paremmin eksoneista rakentuvaan RNA:han introneita sisältävän genomin sijasta. Varsinaisen Q-RT-PCR-reaktion jälkeen suoritettavaa sulamiskäyräanalyysiä sekä agaroosigeeliajoa käytettiin tuotteiden identifiointiin. Jokaisella kaksijuosteisella DNA:lla on ominainen sulamislämpötila (Tm), jossa DNA on yksijuosteisena. Sulamislämpötila riippuu muun muassa DNA-jakson pituudesta sekä GC-pitoisuudesta, jolloin suuri guaniinin ja sytosiinin määrä DNA-juosteessa nostaa sulamislämpötilaa. Myös DNA-juosteen sekundääri- ja tertiäärirakenne vaikuttavat sulamislämpötilaan. Sulamiskäyrän avulla erotetaan epäspesifiset tuotteet ja niin sanotut primer-dimer-tuotteet spesifisistä tuotteista. Yhden Q-RT-PCR-tuotteen osoittamiseksi sulamiskäyrässä tuli olla vain yksi huippu. Tuntemattoman näytteen DNA-määrä voidaan selvittää käyttämällä apuna samasta kohde-dna:sta tehtyä konsentraatioltaan tunnettua standardisuoraa eli laimennossarjaa. Standardisuora piirretään logaritmiselle asteikolle käyttäen standardinäytteiden konsentraatioita ja niiden saamia Ct-arvoja. Standardisuoran onnistumiseen vaikuttavat pipetoinnin tarkkuuden lisäksi myös laitteen asetukset sekä suorituskyky. Standardiarvon perusteella jokaiselle näytteelle saadaan SQ-arvo (starting quantity), joka on verrattavissa toisessa Q-RT-PCR-ajossa saadun mrna:n määrään. 5 LÄHTEET

21 18 Aaltonen K, Ahlin C, Amini RM, ym. Reliability of cyclin A assessment on tissue microarrays in breast cancer compared to conventional histological slides. Br J Cancer 2006;94: Andriole GL, Bostwick DG, Brawley OW, ym. Effect of dutasteride on the risk of prostate cancer. N Engl J Med 2010;362: Attard G, Reid AH, A'Hern R, ym. Selective inhibition of CYP17 with abiraterone acetate is highly active in the treatment of castration-resistant prostate cancer. Journal of Clinical Oncology 2009;27: Balk SP. Androgen receptor as a target in androgenindependent prostate cancer. Urology 2002;60: Banks D, Wu M, Higa LA, ym. L2DTL/CDT2 and PCNA interact with p53 and regulate p53 polyubiquitination and protein stability through MDM2 and CUL4A/DDB1 complexes. Cell Cycle 2006;5: Cai C, He HH, Chen S, ym. Androgen receptor gene expression in prostate cancer is directly suppressed by the androgen receptor through recruitment of lysine-specific demethylase 1. Cancer Cell 2011;20: Carver BS, Tran J, Gopalan A, ym. Aberrant ERG expression cooperates with loss of PTEN to promote cancer progression in the prostate. Nat Genet 2009;41: Chen CD, Welsbie DS, Tran C, ym. Molecular determinants of resistance to antiandrogen therapy. Nat Med 2004;10:33-9. Guan Y, Kuo WL, Stilwell JL, ym. Amplification of PVT1 contributes to the pathophysiology of ovarian and breast cancer. Clinical Cancer Research 2007;13: Higa LA, Banks D, Wu M, Kobayashi R, Sun H ja Zhang H. L2DTL/CDT2 interacts with the CUL4/DDB1 complex and PCNA and regulates CDT1 proteolysis in response to DNA damage. Cell Cycle 2006;5: Hu R, Dunn TA, Wei S, ym. Ligand-independent androgen receptor variants derived from splicing of cryptic exons signify hormone-refractory prostate cancer. Cancer Res 2009;69: Huggins C ja Hodges CV. Studies on prostatic cancer. I. The effect of castration, of estrogen and androgen injection on serum phosphatases in metastatic carcinoma of the prostate. CA: a Cancer Journal for Clinicians 1972;22: Kela I, Harmelin A, Waks T, Orr-Urtreger A, Domany E ja Eshhar Z. Interspecies comparison of prostate cancer gene-expression profiles reveals genes associated with aggressive tumors. Prostate 2009;69: Kokontis J, Takakura K, Hay N ja Liao S. Increased androgen receptor activity and altered c-myc expression in prostate cancer cells after long-term androgen deprivation. Cancer Res 1994;54: Latil A, Bièche I ja Vidaud D. Evaluation of androgen, estrogen (ERα and ERβ), and

22 19 progesterone receptor expression in human prostate cancer by real-time quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction assays.. Cancer Res 2001;61: Linja MJ, Savinainen KJ, Saramaki OR, Tammela TL, Vessella RL ja Visakorpi T. Amplification and overexpression of androgen receptor gene in hormone-refractory prostate cancer. Cancer Res 2001;61: Liu W, Laitinen S, Khan S, ym. Copy number analysis indicates monoclonal origin of lethal metastatic prostate cancer. Nat Med 2009;15: Locke JA, Guns ES, Lubik AA, ym. Androgen levels increase by intratumoral de novo steroidogenesis during progression of castration-resistant prostate cancer. Cancer Res 2008;68: Mohler JL, Gregory CW, Ford OH,3rd, ym. The androgen axis in recurrent prostate cancer. Clinical Cancer Research 2004;10: Montgomery RB, Mostaghel EA, Vessella R, ym. Maintenance of intratumoral androgens in metastatic prostate cancer: a mechanism for castration-resistant tumor growth. Cancer Res 2008;68: Pan HW, Chou HY, Liu SH, Peng SY, Liu CL ja Hsu HC. Role of L2DTL, cell cycle-regulated nuclear and centrosome protein, in aggressive hepatocellular carcinoma. Cell Cycle 2006;5: Pomerantz M, Ahmadiyeh N, Jia L, ym. The 8q24 cancer variant rs demonstrates long range interaction with MYC in colorectal cancer. Nat Genet 2009;41(8): Rio Frio T, Lavoie J, Hamel N, ym. Homozygous BUB1B mutation and susceptibility to gastrointestinal neoplasia. N Engl J Med 2010;363: Sansam CL, Shepard JL, Lai K, ym. DTL/CDT2 is essential for both CDT1 regulation and the early G2/M checkpoint. Genes Dev 2006;20: Seruga B, Ocana A ja Tannock IF. Drug resistance in metastatic castration-resistant prostate cancer. Nature Reviews Clinical Oncology 2011;8: Sharma A, Yeow WS, Ertel A, ym. The retinoblastoma tumor suppressor controls androgen signaling and human prostate cancer progression. J Clin Invest 2010;120: Stanbrough M, Bubley G ja Ross K. Increased expression of genes converting adrenal androgens to testosterone in androgen ind pendent prostate cancer.. Cancer research, Cancer res 2006;66: Swinnen JV, Heemers H, van de Sande T, ym. Androgens, lipogenesis and prostate cancer. Journal of Steroid Biochemistry & Molecular Biology 2004;92: Taplin ME, Bubley GJ, Shuster TD, ym. Mutation of the androgen-receptor gene in metastatic androgen-independent prostate cancer. N Engl J Med 1995;332:

23 Thompson IM, Goodman PJ, Tangen CM, ym. The influence of finasteride on the development of prostate cancer. N Engl J Med 2003;349: Tomlins SA, Rhodes DR, Perner S, ym. Recurrent fusion of TMPRSS2 and ETS transcription factor genes in prostate cancer. Science 2005;310: Ueki T, Nishidate T, Park JH, ym. Involvement of elevated expression of multiple cell-cycle regulator, DTL/RAMP (denticleless/ra-regulated nuclear matrix associated protein), in the growth of breast cancer cells. Oncogene 2008;27: Urbanucci A, Sahu B, Seppa J, ym. Overexpression of androgen receptor enhances the binding of the receptor to the chromatin in prostate cancer. Oncogene 2011;69(20): Visakorpi T, Hyytinen E, Koivisto P, ym. In vivo amplification of the androgen receptor gene and progression of human prostate cancer. Nat Genet 1995;9: Waltering KK, Helenius MA, Sahu B, ym. Increased expression of androgen receptor sensitizes prostate cancer cells to low levels of androgens. Cancer Res 2009;69: Yu J, Yu J, Mani RS, ym. An integrated network of androgen receptor, polycomb, and TMPRSS2- ERG gene fusions in prostate cancer progression. Cancer Cell 2010;17: LIITTEET Liite 1 Liuotuspuskuri 1% SDS 10 mm EDTA 50 mm Tris-HCL, ph 8,1 2 x Complete Protease Inhibitor (Roche Inc) Laimennospuskuri 1 % Triton X mm EDTA 150 mm NaCl 20 mm Tris-HCl, ph 8,1 TSE I 1 % Triton-X % SDS 2 mm EDTA 150 mm NaCl 20 mm Tris-HCl, ph 8