Kudosmalli biofilmi-isäntä vuorovaikutuksen tutkimiseen. Laura Ahervo. Ohjaajat: FM Annamari Paino ja FT Riikka Ihalin BIOKEMIA

Transkriptio

1 Kudosmalli biofilmi-isäntä vuorovaikutuksen tutkimiseen Laura Ahervo Ohjaajat: FM Annamari Paino ja FT Riikka Ihalin BIOKEMIA Yksi tärkeimmistä aggressiivisen parodontiitin (hampaan kiinnityskudosten tulehdus) aiheuttajista on gram-negatiivinen Aggregatibacter actinomycetemcomitans, joka muodostaessaan biofilmin erittää ympärilleen biopolymeereistä koostuvan soluväliaineen. Biopolymeerit sekä suojaavat bakteereita että auttavat niitä kiinnittymään erilaisiin pintamateriaaleihin. Biofilmien tiedetään olevan vastustuskykyisiä isännän immuunivasteelle ja heikentävän merkittävästi antibioottien vaikutusta infektioissa. Tässä työssä kehitettiin kudosmallia, jonka avulla biofilmi-isäntä-vuorovaikusta voitaisiin paremmin tarkastella. Ensisijaisena tavoitteena oli selvittää tuottavatko kudosmallin solut interleukiini (IL)-1β:a, parodontiitin keskeistä tulehduksen välittäjäainetta, kun niitä stimuloidaan A. actinomycetemcomitans biofilmeillä. Kudosmalli toteutettiin kerrosviljelmänä, jossa alin kerros koostui ihmisen ikenen fibroblasti (HGF) -kollageeni matriksista ja toinen kerros ikenen keratinosyyteistä (HGK) tai ihon keratinosyyteistä (HaCaT). Kaikki käytetyt solut olivat kuolemattomaksi tehdyistä solulinjoista. Neste-kaasu rajapinnassa kasvaneen viljelmän päälle asetettiin membraani, jonka pinnalle oli kasvatettu A. actinomycetemcomitans biofilmi. Kerrosviljelmiä inkuboitiin membraanin kanssa 0 h ja 8 h. Mediumeista tutkittiin IL-1β:n erittymistä ELISA:n avulla. Eri solulinjojen sekä bakteerien vaikutusta kudosmalliin tarkasteltiin hematoksyliini-eosiini värjättyjen parafiinileikkeiden avulla. Lisäksi IL-1β:n lokalisoimiseksi parafiinileikkeille tehtiin immunohistokemiallinen värjäys. Saatujen tulosten perusteella kudosmallin solut tuottivat IL-1β:a. Ikenen keratinosyyttien havaittiin tuottavan ihon keratinosyyttejä suurempia IL-1 β pitoisuuksia. Lisäksi ELISA tulosten ja immunohistokemiallisten värjäysten perusteella A. actinomycetemcomitans näyttäisi sitovan IL-1β:a, mikä on linjassa aikaisemmin saamiemme tulosten kanssa. Kudosmalli soveltuu IL- 1β:n ja biofilmin välisen vuorovaikutuksen tarkempaan tutkimiseen. Asiasanat: biofilmi, interleukiini-1β, kudosmalli, parodontiitti

2 Bakteerin ulkokalvoproteiini HofQ:n DNA:ta sitovan osan rakenteen määritys Mari Jääskeläinen Ohjaajat: FM Heidi Tuominen, PhD Michael Tarry, assistant professor Martin Högbom, FT Riikka Ihalin BIOKEMIA Gram-negatiivinen Pasteurellaceae-heimoon kuuluva Aggregatibacter actinomycetemcomitans on luonnostaan kompetentti: se kykenee ottamaan solunulkoista DNA:ta soluun. Kompetenssin mekanismia ei tunneta tarkasti, mutta sen ajatellaan koostuvan erillisestä DNA:n sitoutumisesta ja sitä seuraavasta DNA:n otosta solun sisään. Pasteurellaceae-heimon ComE-sekretiinin on todettu muodostavan bakteerin ulkokalvolle kanavan, jonka kautta DNA päätyy soluun. A. actinomycetemcomitansin HofQ, joka on ComE:n homologi toimii luultavasti samankaltaisesti. Alustavat tutkimustuloksemme osoittavat HofQ:n N- terminaalisen osan sitovan DNA:ta, joten HofQ on todennäköisesti osallisena kompetenssissa. Työn tarkoitus oli kiteyttää HofQ:n N-terminaalinen osa ja ratkaista sen rakenne. HofQ:n N-terminaalinen osa (aminohapot ) kloonattiin pet-15b-vektoriin ja ekspressoitiin Escherichia colin BL21-CodonPlus(DE3)-RIL-kannassa. Proteiini puhdistettiin nikkeliaffiniteettikromatografialla, histidiinihäntä poistettiin trombiinidigestiolla ja puhdistus viimeisteltiin geelisuodatuspylväässä. Proteiini kiteytettiin 2 M natriumformaatissa ja 0,1 M natriumasetaatissa (ph 4,6) istuva pisara -menetelmällä +20 ºC:ssa. Kiteistä kerättiin natiivi- ja selenometioniinidatat ESRF:ssä (European Synchrotron Radiation Facility, Grenoble, Ranska). Vaihekulmat selvitettiin MAD-menetelmällä ja lopullisen rakenteen vaihekulmat ratkaistiin molekyylikorvausmenetelmällä. Lisäksi rakenteen ratkaisemisessa käytettiin Auto-Rickshaw-, Refmac5- ja Coot-ohjelmia. HofQ:n tertiäärirakenteen huomattiin osittain muistuttavan E. colin sekretiinien ESCC:n ja GspD:n rakennetta, mutta proteiinin N-terminaalinen osa vaikuttaa olevan ainutlaatuinen. Tällä osalla saattaa olla funktionaalinen merkitys ja se saattaa myös sisältää proteiinin DNA:ta sitovan domeenin. Asiasanat: Aggregatibacter actinomycetemcomitans, HofQ, kompetenssi, röntgensädekristallografia

3 Hiiren EphB6 -reseptorin tuotto ja funktionaalinen analyysi Saara Korpela Ohjaajat: FT Juha-Pekka Himanen, FT Sari Paavilainen BIOKEMIA Tyrosiinikinaasireseptoreiden suurin alaluokka on Eph -reseptorit, jotka sitoutuvat ekstrasellulaarisessa tilassa toiseen membraaniproteiiniperheeseen, efriineihin. Reseptorit jaetaan ligandispesifisyyden perusteella A- sekä B - luokkiin. Eph -reseptorit ekspressoituvat laajasti eri kudoksissa ja eläinlajeissa. Ne osallistuvat muun muassa solujen erilaistumiseen, liikkumiseen, tukirangan muotoutumiseen sekä yksilönkehityksen säätelyyn. Soluissa Eph -reseptorien aktiivisuus kohdentuu esimerkiksi Cdc42, Ras, Rac ja Rho -proteiineihin. EphB6 -reseptori ekspressoituu merkittävästi aivoissa ja kateenkorvassa, joista jälkimmäisessä sen on osoitettu olevan yhteydessä T -lymfosyyttien erikoistumisprosessiin. EphB6 -reseptorilta on havaittu puuttuvan kinaasiaktiivisuus, minkä takia se tarvinnee koreseptorin. EphB6 -reseptorin ligandia sitova domeeni subkloonattiin Escherichia coli sekä Baculovirus -tuottovektoreihin. Liukoinen proteiini puhdistettiin affiniteettipuhdistuksella fuusioproteiinin avulla ja edelleen vahvalla anioninvaihtajalla. Myös efriinejä ekspressoitiin Baculovirus -systeemissä. Ligandi efriini-b1leimattiin europium-n1-kelaatilla. EphB6 -reseptorin ja ligandien välisen sitoutumisen karakterisoimiseksi pyrittiin kehittämään mikrotiitterilevyillä toimiva määritysmenetelmä. Testattiin erilaisia mikrotiitterilevyjä ja blokkausmateriaaleja. Kokeiltiin myös HRP -leimattuun vasta-aineiseen perustuvaa menetelmää. Karakterisoinnin tueksi tehtiin komparatiivista mallinnusta käyttäen teoreettisia rakennemalleja EphB6 - proteiinista. EphB6 -proteiinia kyettiin tuottamaan E. colissa liukoisena sekä inkluusiobodeina. Liukoisen proteiinin ekspressio Baculovirus -infektoiduissa hyönteissoluissa osoittautui optimoinnista huolimatta alhaisemmaksi kuin liukoisen proteiinin osuus E.Colissa. Ligandit, efriinit, ekspressoituivat hyvin Baculovirus -infektoiduissa hyönteissoluissa. Suolakonsentraatiolla, entsyymien alkuperällä ja proteiinipitoisuudella havaittiin olevan merkittävä vaikutus EphB6 -proteiinin saostumiseen digestoitaessa pois fuusioproteiinia. Saostumista ilmeni myös dialyysissä, joka korvattiin geelisuodatuksella. Sopivan mikrotiitterilevyjen blokkausmateriaalin optimoiminen sitoutumismäärityksiä varten jatkuu edelleen. Tarkoituksena on kehittää uusi, tarkempi, pienillä proteiinimäärillä toimiva sitoutumismääritysmenetelmä. Avainsanat: Eph, efriini, tyrosiinikinaasireseptori, europium, koreseptori

4 VEGFR-3 -signalointi verisuonten uudismuodostuksessa Krista Heinolainen Ohjaajat: LT Tuomas Tammela ja akatemiaprofessori Kari Alitalo BIOKEMIA Verisuonten uudismuodostusta eli angiogeneesiä tapahtuu normaalisti sikiönkehityksen ja kuukautiskierron aikana sekä haavojen parantuessa, mutta angiogeneesillä on myös tärkeä merkitys syöpäkasvainten kasvussa ja kehityksessä. Tyrosiinikinaasireseptori VEGFR-3 (verisuonikasvutekijäreseptori-3) ilmenee spesifisesti ainoastaan syöpäkasvaimen verisuonten endoteelisoluissa, joiden kasvua sen signaalit lisäävät. VEGFR-3:n ilmenemistä verisuoniendoteelissä säätelee Notch-signalointireitti, ja VEGFR-3 voi muodostaa heterodimeerejä lähisukulaisensa VEGFR-2:n kanssa ligandiensa VEGF-C:n tai VEGF-D:n sitoutuessa. VEGFR-3 signalointi verisuonissa tunnetaan huonosti. Tämän tutkimustyön tarkoituksena on valottaa VEGFR-3:n signaaleja, interaktiokumppaneita ja geneettisiä säätelymekanismeja verisuoniendoteelissä. Tutkimuksessa käytetään ihmisen endoteelisoluja, joista VEGFR-3:n signalointi estetään spesifisillä sirna oligonukleotideilla tai monoklonaalisilla vastaaineilla. Muutokset solujen (fosfo)proteomissa analysoidaan immunopresipitaatiolla, Western blot-menetelmällä sekä monikohdebloteilla. Heilahdukset geeniekspressiossa detektoidaan kvantitatiivisella reaaliaikaisella PCR:lla. In vitro kokeiden lisäksi käytämme angiogeneesin in vivo tutkimukseen vastasyntyneiden hiirten verkkokalvomallia ja syngeenisiä kasvainmalleja. Käytössämme on hiirikanta, jossavegfr3-geeni voidaan poistaa Cre-rekombinaasin avulla verisuoniendoteelissä haluttuna ajankohtana antamalla hiirelle tamoksifeenia. Verisuoniston morfologiset muutokset analysoidaan immunofluoresenssin avulla. Vegfr3:n poisto hiiressä johti liialliseen verisuonten kasvuun, jonka syyksi osoittautui vähentynyt Notch-signalointi endoteelisoluissa. Paradoksaalisesti VEGFR-3:n estäminen vasta-aineilla vähensi angiogeneesiä ja hidasti kokeellisten kasvainten kasvua. Yllättäen kumpikaan estämismenetelmä ei vaikuttanut VEGFR-2:n määrään tai aktiivisuuteen. Parhaillaan selvitän VEGFR-3:n alavirtasignaalien ja Notch-signaloinnin välistä yhteyttä. Alustavien tulosteni mukaan VEGFR-3 kykenee aktivoimaan Notch-reseptorin aikaisemmin tuntemattomalla mekanismilla. VEGFR-3:n toiminnan tunteminen avaa uusia näkymiä syöpälääkkeiden kehitykselle. Asiasanat: VEGFR-3, angiogeneesi, syöpä, Notch, VEGFR-2

5 Proteomiikka-analyysi echovirus 1:n ja α2β1 integriinin vuorovaikutuksesta Johannes Merilahti Ohjaajat: FT Pekka Rappu, FM Johanna Jokinen ja prof. Jyrki Heino BIOKEMIA Integriinit ovat solukalvolla olevia adheesioreseptoriproteiineja, jotka solukalvon läpäisevinä yhdistävät solun tukirangan soluväliaineen proteiineihin. Integriinit osallistuvat solusignalointiin välittämällä viestejä sisään ja ulos soluista. Integriinejä on 24 erilaista ja ne ovat α- ja β- alayksiköistä koostuvia heterodimeerejä. Echovirus 1 (EV1) käyttää α2β1 integriinejä reseptorinaan päästäkseen solun sisälle. Erikoistyön tarkoituksena oli löytää uusia EV1:n ja α2β1 integriinin vuorovaikutukseen liittyviä signalointikompleksin proteiineja. Työssä Saos α2 - soluja kasvatettiin stabiileilla isotoopeilla leimattuja aminohappoja sisältävässä kasvatusmediumissa (SILAC). EV1 kiinnitettiin magneettipartikkeleihin ja annettiin tarttua Saos α2 -solujen α2β1 integriineihin ja klusteroida ne. Tämän jälkeen signalointikompleksin komponentit kiinnitettiin toisiinsa kovalenttisesti primääristen amiinien kautta DTBP-linkkimolekyyleillä (dimetyyli-3,3'- ditiolibispropionimidaatti) ja proteiinikompleksi eristettiin soluista magneetilla. Proteiinikompleksin proteiinit irrotettiin toisistaan ja eri proteiinit tunnistettiin ja kvantitoitiin LC/MS/MS-ajolla. Konfokaalimikroskopialla havaittiin, että magneettipartikkeleihin kiinnitetyt echovirukset kiinnittyvät solun α2β1 integriineihin ja saavat ne klusteroitumaan. Western-analyyseillä EV1-magneettipartikkelien todettiin kiinnittyvän spesifisesti α2β1 integriineihin, ja signalointikompleksista tunnistettiin proteiineja, joiden tiedetään aktivoituvan EV1:n sitoutuessa α2β1 integriineihin. Alustavissa LC/MS/MS-analyyseissä löydettiin muutamia uusia ehdokkaita EV1:n ja α2β1 integriinien vuorovaikutuskumppaneiksi. Tuloksien perusteella voidaan jo todeta menetelmän toimivan hyvin signalointikompleksien komponenttien etsimisessä. Tätä menetelmää voidaan helposti käyttää myös muiden virus reseptori -vuorovaikutuksien tutkimiseen. Asiasanat: proteomiikka, SILAC, α2β1 integriini, echovirus 1

6 Kindliinin ja taliinin merkitys echovirus 1:den ja α 2 β 1 -integriinin vuorovaikutuksessa Pirjo Tissari Ohjaajat: FM Johanna Jokinen, FM Maria Salmela ja prof. Jyrki Heino BIOKEMIA Integriiniperhe koostuu 24:stä heterodimeeristä, jotka muodostuvat 18 α- ja 8 β-alayksiköstä, ja ne ovat tärkeitä solukalvon reseptoreita. Integriinit ovat perinteisen käsityksen mukaan inaktiivisessa tilassa ollessaan taipuneessa muodossa. Tällöin ligandin sitoutuminen on heikkoa, mutta tuoreet tutkimustulokset osoittavat, että α 2 β 1 -integriini sitoo inaktiivisessa muodossa echovirus 1:den (EV1). EV1 on ihmisen patogeeni, joka on Picornavirusperheeseen kuuluva RNA-virus. EV1 aiheuttaa aivokalvontulehdusta, sydäntulehdusta, ihottumaa, sekä lieviä hengitys- ja ruuansulatuselimistön sairauksia. Taliini on sytoskeletaalinen proteiini, jonka N-terminaalisessa päässä on FERM-alayksikkö (4,1/Ezrin/Radixin/Moesin). Kindliineissä on myös FERM-alayksikkö, joka on C-terminaalisessa päässä. On todettu, että kindliinin ja taliinin FERM-alayksiköt sitoutuvat β1-integriinin häntään ja ne osallistuvat β 1 -integriinien aktivointiin. Kindliinin ja taliinin merkitystä EV1:den kiinnittymiseen α 2 β 1 -integriiniin ja viruksen internalisaatioon soluun tutkittiin hiljentämällä geenit RNAinterferenssillä ja yliekspressoimalla kindliiniä ihmisen osteosarkoomasoluissa (Saos 2) ja keratinosyyteissä (HaCaT). Kindliinin ja taliinin geenien hiljentyminen todettiin mrna-tasolla kvantitatiivisella reaaliaikaisella PCR:llä ja proteiinitasolla western blottauksella. Taliinin ja kindliinin sijainti soluissa määritettiin konfokaalimikroskopialla ilman virusta ja virustartutuksen jälkeen, ja taliinin vaikutusta EV1:den kiinnittymiseen solupinnan α 2 β 1 -integriiniin määritettiin adheesiokokeella. Kindliinin ja taliinin vaikutusta EV1:den kykyyn infektoida kohdesolu tutkittiin määrittämällä infektioprosentit soluista, joihin oli tehty sirna-transfektio. Saos α2-solut ilmentävät normaalisti vain vähän kindliiniä ja tutkimuksissa havaittiin, että virus tarttui heikommin soluihin, joissa kindliiniä yliekspressoitiin. Adheesiokokeessa saatujen tulosten perusteella EV1 tarttuu paremmin soluihin, joissa on vähemmän taliinia ja infektiokokeissa todettiin että solut, joihin on transfektoitu taliini-sirna, infektoituvat paremmin kuin käsittelemättömät solut. Kaikki tulokset tukevat havaintoa, että echovirus 1 suosii soluja, joissa on vähemmän integriinejä aktivoivia proteiineja. Asiasanat: kindliini, taliini, echovirus 1, α 2 β 1 -integriini

7 Akt kinaasin eri isomuodot integriinien säätelyssä Reetta Virtakoivu Ohjaaja: Prof. Johanna Ivaska BIOKEMIA Integriinit ovat α- ja β-alayksiköstä koostuvia solun pinnan heterodimeerisiä tarttumisreseptoreita. Ne välittävät solun adheesiota soluväliaineeseen ja toisiin soluihin. Niillä on tärkeä rooli solusignaloinnissa ja ne osallistuvat muun muassa solun kasvun, erilaistumisen ja liikkumisen säätelyyn. Akt (proteiini kinaasi B, PKB) kinaasit ovat seriini/treoniini proteiinikinaaseja, jotka osallistuvat solun selviytymisen, apoptoosin, solun kasvun ja proliferaation säätelyyn. Akt-kinaasiperheeseen kuuluu kolme tunnettua isomuotoa: Akt1 (PKBα), Akt2 (PKBβ) ja Akt3 (PKBγ). Ne ovat yli 80 %:sti homologisia keskenään ja kaikkien isomuotojen aktivaatiomekanismin uskotaan olevan sama. Ne aktivoituvat fosforylaation seurauksena. Akt1 ja Akt2 kinaaseja on tutkittu paljon, mutta sen sijaan Akt3 kinaasin rooli on vielä epäselvä. Ryhmässämme löydettiin geenien vaimentamiseen perustuvan high throughput seulonnan avulla Akt1 isomuodon hiljentämisen lisäävän β 1 -integriinin aktiivisuutta eturauhassyöpäsoluissa, kun taas Akt3 isomuodon hiljentämisen vähentävän sitä. Erikoistyöni tarkoituksena oli tutkia tarkemmin eri Akt isomuotojen merkitystä integriinien aktiivisuuden säätelyssä. Työn ensimmäisessä osiossa integriinien aktiivisuuden muutoksia tutkittiin PC-3 soluissa, joista joko hiljennettiin tai niissä yliekspressoitiin Akt:n eri isomuotoja. Hiljentämisen onnistuminen varmistettiin Western blot-analyysilla ja solun pinnan aktiivisen integriinin määrää mitattiin virtaussytometrillä (FACScan). Toisessa osiossa suoritettiin in vitro kinaasianalyysiin perustuva high throughput seulonta, jonka tarkoituksena oli etsiä Akt3 isomuodolle spesifisiä inhibiittoreita. Saatujen tulosten perusteella sekä Akt1 että Akt2 isomuodon vaimentamisen huomattiin lisäävän β 1 -integriinin aktiivisuutta huomattavasti. Akt3 isomuodon vaimentamisella ei ollut merkittävää vaikutusta siihen. Akt:n isomuodot vaikuttavat siis eri tavoin integriinien aktiivisuuteen. Suoritetuissa primääri- ja sekundääriseulonnoissa löydettiin useita Akt kinaaseja inhiboivia yhdisteitä, mutta yksikään niistä ei ollut spesifinen ainoastaan Akt3 isomuodolle. Avainsanat: Integriini, Akt kinaasi, high throughput seulonta

8 CT16:n kanssa vuorovaikuttavien proteiinien seulonta hiivakaksoishybridimenetelmällä Janica Mäkelä Ohjaajat: FM Camilla Nylund, prof. Jyrki Heino BIOKEMIA CT16 kuuluu syöpä/kives-antigeeneihin (CT-antigeenit, engl. cancer/testisantigens), jotka ilmentyvät erilaisten syöpien lisäksi vain ituradassa ja trofoplasteissa sekä hyvin rajallisesti aikuisen somaattisissa kudoksissa. Rajoittuneen ilmentymisen ja immunogeenisten ominaisuuksiensa vuoksi CTantigeeneja voitaneen hyödyntää syövän immunoterapiassa. CT16 tunnetaan myös nimillä PAGE5 ja GAGEE1. GAGE-perheen proteiinit, CT16 mukaan lukien, tunnetaan toiminnaltaan hyvin huonosti. Todennäköisesti niiden tehtävät ituradassa liittyvät sukusolujen muodostumiseen ja selviytymiseen. Aktivoituessaan somaattisissa soluissa niiden ajatellaan vaikuttavan kasvaimen muuttumiseen pahanlaatuiseksi. CT16:n toiminnan selvittämiseksi on tärkeää tietää, minkä proteiinien kanssa se on vuorovaikutuksissa. Tähän tarkoitukseen käytettiin hiivakaksoishybridimenetelmää. CT16:n geeni kloonattiin pgbkt7-plasmidiin, jolla transformoitiin Saccharomyces cerevisiae AH109 -hiivakanta. Ihmisen universaali normalisoitu cdna-kirjasto (Clontech) oli pgadt7-recab-plasmidissa ja S. cerevisiae Y187 -hiivakannassa. Seulontaa varten nämä kannat pariutettiin (engl. mate) keskenään ja muodostuneita diploideja kasvatettiin selektiivisillä SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-Gal-maljoilla. Jotkin näiden maljojen sinisten pesäkkeiden cdna-insertteistä monistettiin pesäke-pcr:llä ja sekvensoitiin. Sekvenssejä verrattiin BLAST-haulla tietokantoihin, minkä jälkeen mielenkiintoisimpien proteiinien vuorovaikutus varmistetaan uusintatransformaatiolla ilman CT16:n läsnäoloa. Seulonta kattoi 25,8 miljoonaa kloonia eli moninkertaisesti koko ihmisen cdna-kirjaston. Niiden joukosta noin 800 kloonia antoi positiivisen tuloksen selektiivisillä maljoilla. Näistä lopulta 46 valittiin sekvensointiin. Näiden joukossa oli 35 erilaista tunnettua proteiinia ja kahdeksan, joiden nukleotidisekvenssille ei tunneta vastaavaa transkriptia. Monet saaduista proteiineista ovat odotetusti apoptoosia estäviä. Toisaalta joukossa on muun muassa myös rakkulaliikenteeseen ja flagellaan liittyviä proteiineja, mistä saa ehkä viitteitä CT16:n toiminnasta kiveksissä. Asiasanat: syöpä/kives-antigeenit, hiivakaksoishybridimenetelmä, proteiini proteiini-vuorovaikutus

9 Mechanism of assembly and repair of iron sulfur clusters in cyanobacteria Linda Vuorijoki Supervisor: Ph.D. Patrik R. Jones BIOCHEMISTRY Cyanobacteria can synthesize hydrogen using only solar energy as the main driving force (phototrophic metabolism). The main issue with phototrophic H 2 - production is that the photosynthetic by-product, oxygen (O 2 ), damages enzymes that catalyze H 2 -synthesis, particularly iron sulfur (Fe-S) cluster containing hydrogenases. The sufr gene product SufR has been demonstrated to act as a negative transcriptional regulator of the sufbcds operon, which is responsible for assembly and possibly repair of protein-bound Fe-S clusters, particularly under conditions of oxidative stress. A major goal of the master s project was to determine the effect of sufr deletion on H 2 -production and hydrogenase activity in relation to O 2 -exposure. The aim was to construct a fully segregated, null mutation in the sufr gene of Synechocystis sp. PCC strain (S. 6803) by fusion-pcr, after which the construct was used to transform in S through homologous recombination. The effect of sufr deletion on Fe-S cluster metabolism will be determined later by native hydrogenase activity assays in both Synechococcus sp. PCC and S sufr deletion strains. The effect of sufr deletion on other native Fe-S cluster enzymes and growth rate will also be determined. The enzyme activity measurements will be based on enzyme-substrate reactions which will be assayed by spectrophotometer. Besides focusing on Fe-S cluster metabolism, over-expression of a 6-histidine affinity-tagged native (His-hox) and recombinant (His-hydA) hydrogenases was also tried to achieve in S Construction of strains over-expressing hydrogenase genes, were tried by traditional ligation based cloning and by fusion-pcr. The final part of my master s thesis is to cultivate S isca, sufa and sufr mutants in iron deplete growth conditions and to extract RNA from the mutants for microarray analysis. Constructs of hydrogenase over-expressing strains were not achieved unlike SufR deletion strain. It s hypothesized that deletion of sufr will enhance the ability for cyanobacteria to repair damaged Fe-S clusters and thus enhance H 2 - production. The effect is likely to be most obvious under high light conditions and/or following O 2 -exposure. The IscA and SufA proteins are hypothesized to be involved in the regulation of Fe-S cluster metabolism in cyanobacteria. Keywords: cyanobacteria, H 2 -production, Fe-S clusters, fusion-pcr

10 Lantanidileimoihin perustuva hepatiitti B ja hepatiitti C -kaksoisleimamääritys Liisa Valtonen Ohjaajat: LuK Teppo Salminen, FM Tiina Myyryläinen, prof. Tero Soukka ja prof. Kim Pettersson MOLEKULAARINEN BIOTEKNIIKKA JA DIAGNOSTIIKKA Hepatiitti B - (HBV) ja hepatiitti C -virus (HCV) aiheuttavat maksatulehduksen, joka voi kroonisena johtaa maksakirroosiin ja -syöpään. Koska molemmat virukset tarttuvat veriteitse, on infektioiden havaitseminen tärkeää esimerkiksi luovutettua verta seulottaessa. Nukleiinihappomäärityksiin verrattuna immunomääritykset ovat edullisempia ja yksinkertaisempia ja siksi parempi vaihtoehto muun muassa kehittyviin maihin. Tavoitteena oli pystyttää edullinen immunomääritys, jonka avulla yhdestä seeruminäytteestä havaitaan samanaikaisesti HBV- ja HCVinfektiot. Määrityksessä anti-hcv-vasta-aineet sitoutuivat multiepitooppiproteiiniin (MEP), joka koostuu useista HCV-spesifisistä epitoopeista. Hepatiitti B:n pinta-antigeeni (HBsAg) sitoutui monoklonaaliseen vasta-aineeseen. Anti-HCV-vasta-aineet havaittiin Tb-leimatulla sekundaari-vasta-aineella tai MEP:lla ja HBsAg havaittiin vasta-ainefragmenteilla päällystetyillä Eu-nanopartikkeleilla. Optimoinnissa käytettiin analyytteina rekombinanttista HBsAg:a ja MEP:lla immunisoitua seerumia. Määritys validoitiin testaamalla 141 kaupallisilla määrityksillä tutkittua potilasnäytettä, HCV-genotyyppipaneeli ja HCV-serokonversiopaneeli. HCV-määritysten herkkyydeksi saatiin 86 % ja spesifisyydeksi 98 % molemmilla HCV-sitojilla. Määritykset tunnistivat HCV-serokonversiopaneelista infektion samaan aikaan kuin parhaat kaupalliset määritykset. HCV-genotyyppipaneelista määritys ei tunnistanut yhtä heikkoa positiivista näytettä. Rekombinanttisella HBsAg:lla tehtyjen kalibrointikäyrien perusteella kaksoismääritysten herkkyydet olivat samat kuin yksittäisen HBV-määrityksen. Potilasnäytteillä HBVmäärityksen herkkyydeksi saatiin 88 % ja spesifisyydeksi 96 %, kun käytettiin sekundaari-vasta-ainetta. MEP:a käytettäessä spesifisyys oli 100 %, mutta herkkyys laski 63 %:iin johtuen MEP-Tb:n aiheuttamasta korkeammasta epäspesifisestä taustasta seeruminäytteillä. Tulosten perusteella määritys, jossa käytettiin Tb-leimattua sekundaarista vasta-ainetta, todettiin parhaaksi. Asiasanat: Hepatiitti B, hepatiitti C, immunomääritys, kaksoisleimamääritys

11 TSH-immunomäärityksen optimointi ja mikrofluidiikan hallinta vieritestaukseen soveltuvalla määritysalustalla Aarne Lemponen Ohjaaja: FM (väit.) Lasse Välimaa MOLEKULAARINEN BIOTEKNIIKKA JA DIAGNOSTIIKKA Keskitettyihin laboratoriotutkimuksiin verrattuna potilaan tai näytteenottopaikan läheisyydessä tehtävä vieritestaus on useimmiten halvempaa, helpompaa ja huomattavasti nopeampaa, eikä testin suorittamiseen välttämättä vaadita erityiskoulutettua henkilökuntaa. Työssä hyödynnettiin usean eri analyytin kanssa toimivaa vieritestaukseen sopivaa testikasettia jolla kehitettiin määritys tyreotropiinille (kilpirauhasta stimuloiva hormoni, TSH). Kasetilla on tarkoitus yhdistää reaktiopinnan signaalia vahvistavat nanorakenteet, mikrofluidiset ominaisuudet (pieni näytekoko sekä käytetyt tilavuudet) ja nanopartikkelileimojen herkkyys ja spesifisyys. Työssä optimoitiin Eu-ioneja sisältäviä 107 nm:n ja 92 nm:n polystyreeninanopartikkeleita sekä kahta eri anti-tsh vasta-ainetta hyödyntävä heterogeeninen sandwich-tyyppinen immunomääritys uudelle määrityskasetille. Työssä tarkasteltiin immunomäärityksen optimaaliselle toiminnalle olennaisia asioita kuten lämpötilaa määrityksen eri pisteissä, reaktiotilavuuksia ja aikoja, puskureiden koostumuksia ja pitoisuuksia, leima-ainemääriä, säilytysolosuhteita sekä mikrofluidiikan vaikutuksia ja toimintaa tietokoneohjatulla ruiskumekaanisella järjestelmällä. Diagnostiikkakasetin reaktiokammion pesutekniikat sekä pesuaineen vahvuus sekä koostumus olivat myös tarkasteltavina. Nanopartikkeleiden tuottama pitkäikäinen fluoresenssi skannattiin reaktiokammion pinnalta Victor-levylukijalla. Haastetta työhön toi mikrofluidiikan hallinta (nesteliikkeet ja kuplanmuodostus) ja reaktiokammion onnistunut pesu. Määritys toimii teknisesti hyvin ja oikealla tavalla. Määritysaika oli 15 minuuttia. Aivan pienimpiä pitoisuuksia ei kuitenkaan vielä kyetä erottamaan taustasta. TSH-määrityksen optimointi tuotti runsaasti teknistä perustietoa heterogeenisen immunomäärityksen toimivuudesta kasettiympäristössä, mikä helpottaa muiden samalla periaatteella toimivien määritysten käyttöönottoa. Määritysjärjestelmää voidaan tulevaisuudessa käyttää esimerkiksi kilpirauhasen vajaa -tai liikatoiminnan havaitsemisen lisäksi sydäninfarktin varhaiseen toteamiseen nopeasti ja kustannustehokkaasti. Asiasanat: Diagnostiikka, mikrofluidiikka, nanopartikkelit, vieritestaus

12 Streptavidiinipinnoitetun mikrotiitterilevyn sitomisominaisuuksien parantaminen Veikko Wahlroos Ohjaajat: FT Leena Kokko, FT Katri Kuningas MOLEKULAARINEN BIOTEKNIIKKA JA DIAGNOSTIIKKA Streptavidiini (SA) on 60 kda:n kokoinen tetrameerinen molekyyli. Sen eikovalenttinen sidos biotiinia kohtaan on affiniteetiltaan suurimpia mitä tunnetaan (K a =2.5 x M -1 ). Immunomääritys on usein käytetty menetelmä proteiinien tai muiden pienten molekyylien kvantitatiiviseen mittaamiseen, jossa biotinyloidut vasta-aineet sidotaan SA pinnoitettuun kuoppaan. Työn tarkoituksena oli pinnoittaa levyjä SA:lla eri menetelmiä käyttäen ja tutkia niitä ominaisuuksia, jotka ovat merkityksellisiä immunomääritysten tulosten kannalta. Työssä pinnoitettiin SA mikrotiitterilevylle passiivisella adsorptiolla, tioloidulla SA:lla (SH-SA), polymeroidulla SA:lla, ja polymeroidulla SH- SA:lla. Levyt karakterisoitiin määrittämällä biotiinin sitomiskapasiteetti, SA:n irtoaminen, leimatun määrityskomponentin epäspesifinen sitoutuminen sekä tehtiin immunofluorometrinen määritys, jossa käytettiin analyyttinä eturauhasspesifistä antigeeniä (PSA). Suhteessa passiivisesti pinnoitettuun SA:han polymeroitu SH-SA sitoo 3,6- kertaa, polymeroitu SA 3,1-kertaa ja SH-SA 2,4 kertaa enemmän biotiiniä. SA:n irtoamisen ja sitomiskapasiteetin suhde oli passiivisesti pinnoitetulla SA:lla polymeroituun SH-SA:han 23 kertaa, SH-SA:han 10 kertaa ja polymeroituun SA:han 3 kertaa suurempi. Totaali PSA -määrityksen taustasignaali ja LLD (lowest limit of detection) ovat hieman pienempiä passiivisesti pinnoitetulla levyllä kuin muilla SA levyillä, mutta määrityksen eri levyjen standardisuorat ovat lähes identtiset. Pinnoitusmenetelmillä on suuri vaikutus SA-levyjen ominaisuuksiin. Määrityksen vaatiessa suuren kapasiteetin lisäksi pientä irtoamista levy kannattaa pinnoittaa polymeroidulla SH-SA:lla. Asiasanat:Streptavidiini, biotiini, immunomääritys, levypinnoitus

13 mrna-määritys mikrokystiinejä tuottaville syanobakteereille Nina Elonen Ohjaajat: LuK Henna Hautala ja FM Markus Vehniäinen MOLEKULAARINEN BIOTEKNIIKKA JA DIAGNOSTIIKKA Syanobakteerit eli sinilevät ovat yleisiä erilaisissa vesistöissä. Osa niistä tuottaa monenlaisia toksiineja, joista hepatotoksiset eli maksalle myrkylliset mikrokystiinit ovat Suomen oloissa yleisimpiä. Mikrokystiinit ovat rengasrakenteisia heptapeptidejä, joiden rakenteessa on useita ei-proteinogeenisiä aminohappoja sekä kaksi vaihtelevaa L-aminohappoa. Harvinainen Addaaminohappo on mikrokystiinien toksisuuden kannalta tärkeä, ja sen biosynteesistä vastaavat geenit ovat hyvin konservoituneita mikrokystiinejä tuottavilla syanobakteereilla. Mikrokystiinejä tuottavat muun muassa Anabaena-, Microcystis- ja Planktothrix-sukuihin kuuluvat syanobakteerit. Työssä kehitettiin heterogeeninen hybridisaatiomääritys aktiivisesti mikrokystiinejä tuottavien syanobakteerien havaitsemiseksi. Määrityksen kohde on Adda-aminohapon biosynteesiin osallistuvan mcyd-geenin mrna. Työssä suunniteltiin kaksi kohteelle komplementaarista oligonukleotidiä, jotka mrna:n kanssa hybridisoituessaan muodostavat 3WJ-rakenteen (engl. three way junction). Syntynyt DNA-mRNA-hybridi detektoidaan oligonukleotideillä päällystetyillä europiumnanopartikkeleilla. Määrityksen herkkyyden optimoinnissa käytettiin synteettistä yksinauhaista DNA-templaattia helposti hajoavan mrna:n sijaan. Määrityksen toimivuus testattiin Microcystis aeruginosa -syanobakteerista eristetyllä totaali-rna:lla. Määrityksellä pitäisi olla mahdollista havaita samanaikaisesti niin Anabaena-, Microcystis- kuin Planktothrix-suvun syanobakteerien mikrokystiinien tuotto. Määrityksen avulla voitiin havaita 1 pm DNA-templaattipitoisuus. Määrityksen osoitettiin toimivan eristetyllä RNA:lla, jolla saatiin kvalitatiivisesti positiivinen tulos. Detektiossa kontrollina käytetty genominen DNA ei detektoitunut, joten määrityksen signaali oli peräisin kohde-mrna:sta. Kehitetty menetelmä mahdollistaa mcyd-geenin ekspression havaitsemisen ilman kohde-mrna:n monistamista. Asiasanat: mikrokystiini, syanobakteeri, mrna-määritys

14 DNA-tyypitysmääritys adenoviruksille Maija Karp Ohjaajat: FM Minna Ylihärsilä ja prof. Tero Soukka MOLEKULAARINEN BIOTEKNIIKKA JA DIAGNOSTIIKKA Adenovirukset ovat DNA-viruksia, jotka on luokiteltu 52:een serotyyppiin ja edelleen kuuteen lajiin A F. Adenovirukset voivat aiheuttaa infektioita useissa elimissä kuten keuhkoissa, hengitysteissä ja silmissä. Adenovirusinfektioiden esiintyvyys on suurta, mutta adenovirusinfektio on hankala erottaa muiden virusten tai bakteerien aiheuttamista hengitystieinfektioista. Tämän työn tavoitteena oli pystyttää adenoviruksille DNA-tyypitysmääritys, jossa leiman havainnointiin käytettiin kuvantavaa levylukijaa. Määrityksen tarkoitus oli toimia mallina monianalyyttimäärityksestä uudelle kuvantavalle mittalaitteelle, jonka etuina ovat edullisuus, yksinkertaisuus ja nopeus. Työssä suunniteltiin kymmenen spesifistä koetinta, joiden yhdistelmillä voidaan tunnistaa kymmenen eri adenovirustyyppiä. Koettimet printattiin mikrotiitterilevyn kaivon pohjalle VTT:llä. Lisäksi määrityskaivoon printattiin kontrolleiksi kaksi geneeristä koetinta, jotka tunnistavat kaikki adenovirusserotyypit. Reaaliaikaisella kvantitatiivisella PCR:llä monistettiin biotinyloiduilla alukkeilla 167 nukleotidin pituinen alue adenovirusten heksonigeenin konservoituneelta 4-alueelta. PCR-tuote denaturoitiin ja yksinauhainen biotinyloitu juoste hybridisoitiin määrityskaivon pohjalle kovalenttisesti kiinnitettyjen koettimien kanssa. Hybridisaation detektointiin käytettiin leimoina streptavidiinilla pinnoitettuja upkonvertoivia fosforipartikkeleita (engl. upconverting phosphors, UCP) sekä UCP-partikkeleille soveltuvaa kuvantavaa levylukijaa. UCP-partikkelien soveltuvuutta leimoiksi tutkittiin vertaamalla niitä streptavidiini-pinnoitettuihin Eu(III)-nanopartikkeleihin, jotka havainnoitiin aikaerotteisella fluoresenssimikroskoopilla. Spesifisten koettimien sekvenssien suunnittelu onnistui. DNA-tyypitysmääritys tunnistaa oikein kymmentä adenovirusserotyyppiä vastaavat synteettiset 5 - biotinyloidut yksijuosteiset oligonukleotidit. Määritys voidaan toteuttaa sekä Eu(III)-nanopartikkeleilla että UCP-partikkeleilla. UCP-partikkeleita käytettäessä etuna on kuvauslaitteiston yksinkertaisuus, koska aikaerotteista mittausta ei tarvita, sillä autofluoresenssia ei tapahdu. Mittauslaite soveltuu hyvin monianalyyttimäärityksiin, joissa tavoitteena on havaita useampi analyytti yhdellä kertaa. Asiasanat: adenovirus, kuvantaminen, upkonvertoivat fosforit

15 Chlamydia trachomatis -PCR-määrityksen kehittäminen Antti-Heikki Tapio Ohjaajat: FM Ari Lehmusvuori ja FM Ulla Karhunen MOLEKULAARINEN BIOTEKNIIKKA JA DIAGNOSTIIKKA Klamydia on maailman yleisin sukupuolitauti. Taudin aiheuttaja Chlamydia trachomatis -bakteeri tarttuu suojaamattomissa seksikontakteissa. Taudin itämisaika on 1 3 viikkoa ja se on suuressa osassa tartuntoja oireeton. Oireisessa tulehduksessa esiintyy erilaisia virtsatieoireita. Oireettomanakin se voi silti aiheuttaa naisille klamydiatulehduksen ja munatorvien arpeutumisen kautta lapsettomuutta. Miehillä hoitamaton klamydia voi levitä kiveksiin ja aiheuttaa hedelmättömyyttä. Oireettomuutensa takia tauti leviää helposti. Nykyiset klamydian diagnostiset testit perustuvat erilaisiin nukleiinihappojen monistusmäärityksiin. Määritykset ovat kuitenkin usein paljon aikaa vieviä, monivaiheisia ja sisältävät kohde-dna:n eristämisen virtsanäytteestä. Erikoistyössä kehitettiin klamydialle oligonukleotidikoettimien ohjaamaan kelaattikomplementaatioon perustuva reaaliaikainen homogeeninen PCR-määritys. Määrityksessä kaksi koetinta hybridisoituu vierekkäin monistettuun kohdesekvenssiin muodostaen fluoresoivan kompleksin. Toisessa koettimessa on valoa absorboimaton Eu 3+ -kelaatti ja toisessa Eu 3+ -kelaatin fluoresenssille herkistävä, valoa absorboiva ryhmä. Määritykseen kehitettiin myös Tb 3+ -kelaatilla ja valoa absorboivalla ryhmällä leimatut sisäisen kontrollin tunnistavat koettimet, joilla voitiin havaita monistusta tai fluoresenssisignaalia inhiboivat virtsanäytteet. Menetelmän etuna on, että sillä voidaan saavuttaa suurempi herkkyys ja nopeus, koska taustafluoresenssi on vähäistä. Erikoistyössä pyrittiin myös nopeuttamaan ja yksinkertaistamaan virtsanäytteiden esikäsittelymenetelmiä. Koettimet toimivat määrityksessä hyvin. Puhtailla DNA-templaateilla signaalitaustasuhteiksi saatiin koetinpitoisuuksista riippuen parhaimmillaan Eu 3+ - koetinparilla n. 200 ja Tb 3+ -koetinparilla n. 50. Suhteet ovat moninkertaisia verrattuna nykyisiin homogeenisiin koetinteknologioihin. Potilasnäytteiden signaali-taustasuhteet jäivät usein alhaisemmiksi virtsan inhibiittoreista ja kiintoaineesta johtuen. Uusi leimateknologia soveltuu hyvin reaaliaikaisiin PCRmäärityksiin ja myös nopeasti ilman DNA-eristystä käsitellyille potilasnäytteille. Asiasanat: klamydia, PCR, näytteen esikäsittely, virtsa

16 Tyrnimehusta pylväskromatografialla erotettujen sokerijakeiden sekä L-kvebrakitolin aistittavan laadun arviointi Sari Puputti Ohjaajat: FM Oskar Laaksonen, FT Baoru Yang, FT Mari Sandell, prof. Heikki Kallio ELINTARVIKEKEMIA Erilaisissa olosuhteissa kasvaneet ja eri alalajien tyrnimarjat (Hippophaë rhamnoides L.) ovat erilaisia sekä maultaan että kemialliselta koostumukseltaan. Esimerkiksi ssp. sinensis maistuu makeammalta ja sen ( )- 2-O-metyyli-L-chiro-inositolin (L-kvebrakitoli) pitoisuus on korkeampi kuin ssp. rhamnoidesin, joka on happamampi ja etyyli-β-d-glukosidipitoisuudeltaan korkeampi. Tyrnin maun kannalta merkittäviä yhdisteitä ovat orgaaniset hapot, sokerit ja fenoliset yhdisteet. Erityisesti sokerien ja happojen pitoisuuksien suhde vaikuttaa mehun makeuteen, mikä liittyy myös tyrnimehun miellyttävyyteen ja hyväksyttävyyteen. Sokeri-happosuhde on tyrnimarjoilla huomattavasti pienempi kuin marjoilla ja hedelmillä yleensä. Työn tavoitteena oli kehittää menetelmä etyyli-β-d-glukosidin erottamiseen tyrnimehusta sekä vertailla aistinvaraisesti ioninvaihtokromatografialla tyrnimehusta saatavan sokerijakeen, etyyli-β-d-glukosidin ja kaupallisen L- kvebrakitolin makuprofiileja. Sokerijakeiden keräämiseen käytettiin pylväskromatografiaa, jolloin tyrnimehun sokerit saatiin erotetuksi orgaanisista hapoista ioninvaihtokromatografialla. Osa näin kerätystä sokerijakeesta säästettiin aistittavan laadun arviointeja varten ja osa fraktioitiin toisella pylväällä etyyliβ-d-glukosidin puhdistamiseksi muista sokereista. Sokeri- ja happojakeet analysoitiin kaasukromatografisesti. Vesiliukoisina yhdisteinä osa fenolisista yhdisteistä eluoitui sokerijakeisiin, joten täysin puhtaita sokerijakeita ei saatu. Sokerijakeiden fenoliset yhdisteet määritettiin HPLC-MS-laitteistolla. Näytteiden aistittavan laadun tutkimus on kesken. Avainsanat: etyyli-β-d-glukosidi, L-kvebrakitoli, pylväskromatografia, tyrni

17 Fenoliyhdisteiden karakterisointi intian karviaismarjasta (Phyllanthus emblica L.) Maaria Kortesniemi Ohjaajat: FM Pengzhan Liu, FT Baoru Yang ja prof. Heikki Kallio ELINTARVIKEKEMIA Intian karviaismarja (Phyllanthus emblica L.) on Kaakkois-Aasiasta peräisin oleva marja, jota on hyödynnetty mm. Intiassa ja Kiinassa elintarvikkeena ja luonnonlääkinnässä. Karviaista muistuttava vihertävä marja (engl. Indian gooseberry, emblic leafflower fruit) on erittäin ravinteikas ja hyvä antioksidanttien lähde. Erikoistyössä määritettiin tämän marjan fenoliyhdisteitä nestekromatografian ja massaspektrometrian avulla. Kuivattu marjajauhe uutettiin metanolilla ja uute analysoitiin UVdiodirividetektorilla varustetulla HPLC:llä (HPLC-DAD) sekä HPLCsähkösumutusionisaatio-MS:lla (HPLC-ESI-MS). Koska raakauute sisälsi runsaasti fenolisia yhdisteitä, uute haluttiin puhdistaa ja fraktioida pylväskromatografian avulla. Stationaarifaasina käytettiin polyamidia ja yhdisteet eluoitiin vedellä, metanolilla ja 70 % asetonilla. Kerätyt fraktiot analysoitiin HPLC:llä. Tarkoituksena oli eristää fraktioista yksittäisiä yhdisteitä preparatiivisen HPLC:n avulla NMR-analyysia varten, mutta yhdisteet eivät olleet riittävän erottuneita toisistaan. Tämän takia kokeiltiin toisenlaista pylväskromatografiamenetelmää, jossa stationaarifaasina käytettiin Sephadex TM LH-20:ä ja liikkuvana faasina veden, metanolin ja asetonin seoksia. Fraktiot analysoitiin HPLC-ESI-MS:lla. Intian karviaismarjan havaittiin sisältävän runsaasti eri fenoliyhdisteitä. Tunnistetuista yhdisteistä suurin osa oli hydrolysoituvia tanniineja, eli gallus- ja ellagihapon johdannaisia. Näitä olivat mm. galloyylikviinihappo, galaktaarihappogallaatti, galloyyli-hhdp-glukoosi, putranjivaiini A ja geraniini. Sephadex TM LH-20 todettiin tehokkaammaksi stationaarifaasiksi pylväskromatografiassa kuin polyamidi, sillä sen avulla pystyttiin erottamaan useampia yhdisteitä toisistaan. Pylväskromatografia osoittautui tärkeäksi vaiheeksi intian karviaismarjan fenoliyhdisteiden analysoinnissa. Asiasanat: Fenoliyhdisteet, HPLC-DAD, HPLC-ESI-MS, hydrolysoituvat tanniinit, Phyllanthus emblica L.

18 Marjojen vaikutus postprandiaaliseen lipemiaan: metabolinen profilointi NMR-tekniikoilla Anni Lindstedt Ohjaajat: FM Riikka Järvinen, FM Henna-Maria Lehtonen, dos. Jari Sinkkonen, prof. Heikki Kallio ELINTARVIKEKEMIA Ydinmagneettiseen resonanssispektroskopiaan (NMR) perustuva yhdisteiden analysoiminen biologisista näytteistä on nopea tapa saada kokonaisvaltaista tietoa näytteen yhdisteistä. Menetelmää on sovellettu mm. sairauksien riskitekijöiden kartoittamisessa. NMR-profilointimenetelmän on havaittu soveltuvan myös ravinnon metabolisten vaikutusten tutkimuksiin. Menetelmä vaatii hyvin vähän näytteen esikäsittelyä, jolloin herkissä biologisissa näytteissä tapahtuu mahdollisimman vähän yhdisteiden hajoamista tai muita muutoksia. Työssä selvitettiin 1 H-NMR-tekniikkaa käyttäen luonnonmarjojen vaikutusta plasman sekä virtsan aineenvaihduntatuoteprofiiliin rasvapitoisen aterian jälkeen. Monimutkaisten biologisten näytteiden analysoiminen 1 H-NMR-menetelmillä on haasteellista. Esimerkiksi paljon vetyatomeja sisältävät suuret plasman proteiinit näkyvät spektrissä leveinä signaaleina, jotka peittävät alleen suuren joukon muita signaaleja. Käyttämällä erilaisia 1 H-NMR-tekniikoita molekyylimassaltaan eri kokoluokkaa olevia yhdisteitä voidaan tarkastella omissa spektreissään. Spektrien jatkokäsittely tilastollisilla monimuuttujamenetelmillä (PCA sekä PLS-DA) mahdollisti eri aterioiden (tyrni, puolukka, kontrolli) ja aikapisteiden metaboliatuotteiden muutosten paikallistamisen spektristä. Kyseiset spektrin alueet integroitiin ja niiden muutosten tilastollista merkittävyyttä arvioitiin SPSS tilasto-ohjelman avulla. Tähän mennessä saatujen tulosten pohjalta marjojen nauttimisella rasvapitoisen aterian yhteydessä näyttäisi olevan vaikutuksia sekä plasman että virtsan metaboliaprofiiliin. Tyrnin nauttiminen aterian yhteydessä vaikutti merkittävästi plasman lipidiprofiiliin. Lisäksi plasma- ja virtsanäytteissä havaittiin tyrnimarjalle tyypillinen etyyli-β-d-glukoosi, joka ei muuten ole kasvikunnassa yleinen. Puolukka-aterian jälkeiset näytteet erottuivat korkean hippuraattipitoisuuden takia. Hippuraattia syntyy elimistössä maksassa mm. polyfenolisten yhdisteiden metaboliatuotteena. Virtsan hippuraatipitoisuuden nousulla arvellaan olevan yhteyttä puolukan virtsatieinfektiolta suojaavaan vaikutukseen. Avainsanat: aterianjälkeinen, lipemia, metabolia, NMR, pohjoiset marjat

19 Kemiallisen koostumuksen ja rakenteen vaikutus emulsion stabiilisuuteen virvoitusjuomassa Mirka Kaariste Ohjaajat: FT Eila Järvenpää 1, FT Pirjo Rantamäki 1, FT Jukka Kronlöf 2 ja prof. Rainer Huopalahti 1 Maa- ja elintarviketalouden tutkimuskeskus (MTT), 2 Oy Hartwall Ab ELINTARVIKEKEMIA Emulsio on kahden toisiinsa sekoittumattoman nesteen homogeeninen seos. Emulsion pysyvyyteen vaikuttaa muun muassa faasien tilavuussuhteet, jatkuvan faasin viskositeetti, emulgaattorin tehokkuus sekä dispergoituneen faasin partikkelikoko. Virvoitusjuomissa käytetyt emulsiot ovat öljy vedessä -emulsioita, joissa aromaattinen öljy on dispergoituneena vesifaasiin. Virvoitusjuomaemulsioiden on oltava stabiileita puolen vuoden ajan matriisissa, jossa emulsio on satakertaisesti laimennettuna. Erikoistyössä pyritään erilaisten kaupallisten virvoitusjuomaemulsioiden avulla selvittämään mitkä tekijät emulsion kemiallisessa ja rakenteellisessa koostumuksessa vaikuttavat emulsion pysyvyyteen virvoitusjuomassa. Lisäksi työssä pyritään löytämään optimaaliset olosuhteet omien lesitiiniemulsioiden valmistamiseksi. Virvoitusjuomaemulsioiden stabiilisuutta seurataan kolmen kuukauden ajan säilyttämällä emulsioita virvoitusjuomamatriisissa huoneenlämmössä ja seuraamalla pullojen rengasmuodostumia. Emulsioiden rakennetta tarkastellaan kuvantamismenetelmällä mikroskoopilla, jolla saadaan määritettyä öljypartikkeleiden koko. Emulsioiden erottuvuutta mitataan sentrifugoimalla ja sameusmuutoksia UV-VIS-spektrofotometrilla. Tähän mennessä on saatu tuloksia menetelmien toimivuudesta. Sentrifugointiolosuhteita optimoimalla on saatu kvalitatiivisia eroja emulsioiden erottumisen osoittamiseksi. Virvoitusjuomanäytteitä kuvantamalla on havaittu eroja emulsioiden partikkelikokojakaumissa jo tuoreissa näytteissä. Rakenteen vaikutuksesta emulsion säilyvyyteen saadaan kuitenkin tietoa vasta säilytysjakson edetessä pidemmälle. Itsevalmistettujen emulsioiden partikkelikoon pienentämiseksi ja emulsion täydelliseksi homogenoimiseksi tulee emulsion öljyja vesimäärää sekä valmistus- ja homogenointimenetelmää vielä optimoida. Asiasanat: emulsio, partikkelikoko, stabiilisuus, virvoitusjuoma

20 Sumutuskuivaustekniikan soveltaminen antosyaanien ja betalaiinien mikrokapselointiin Ossi Elonen Ohjaajat: FT Eila Järvenpää 1,2, FT Pirjo Rantamäki 2 ja prof. Rainer Huopalahti 1 1 Biokemian ja elintarvikekemian laitos, Turun yliopisto, 2 Maa- ja elintarviketalouden tutkimuskeskus (MTT) ELINTARVIKEKEMIA Antosyaanit ja betalaiinit ovat luonnossa esiintyviä vesiliukoisia väriaineita: antosyaanien väri vaihtelee punaisesta siniseen ja betalaiinien punaisesta keltaiseen. Ne ovat elintarviketeollisuudessa luonnonmukainen vaihtoehto synteettisten väriaineiden käytölle. Antosyaanit ja betalaiinit ovat orgaanisia aineita, joten ne reagoivat herkästi hapen ja muiden aineiden kanssa, mikä aiheuttaa epätoivottuja värimuutoksia. Työn tarkoituksena olikin parantaa antosyaanien ja betalaiinien säilyvyyttä mikrokapseloinnilla, sekä vertailla erilaisten kuorimateriaalien vaikutusta säilyvyyteen. Antosyaanit uutettiin 70 % etanolilla marja-aronian (Aronia mitschurinii) marjojen puristusjätteestä. Betalaiinit eristettiin vesiuutolla raastetusta punajuuresta (Beta vulgaris). Mikrokapselien kuorimateriaaleina käytettiin erilaisia maltodekstriinejä, arabikumia sekä inuliinia. Mikrokapselointi tehtiin sumutuskuivaimella. Lisäksi yksi kontrolli kummastakin väristä pakkaskuivattiin maltodekstriinin kanssa. Saatujen värijauheiden säilyvyyttä seurattiin kuusi viikkoa säilytyskokeessa, jossa jauheita säilytettiin erilaisissa olosuhteissa (6 C kylmähuoneessa, huoneenlämmössä pimeässä sekä valossa, ja 60 C lämpökaapissa). Jauheista otettiin näytteet säilytyskokeen alussa, puolessa välissä sekä lopussa. Näytteistä mitattiin väri spektrofotometrilla sekä CieLab-menetelmällä. Lopuksi näytteet analysoitiin HPLC-DAD:lla. Kummankin värin mikrokapselointi onnistui hyvin sumutuskuivaimella. Tulosten analysointi on vielä kesken, mutta alustavasti näyttäisi siltä, että arabikumi ja arabikumin ja maltodekstriinin seos olisivat hieman parempia kuorimateriaaleja kuin maltodekstriinit yksinään. Inuliini ei kestä kuumuutta, mutta muuten vaikuttaa toimivan kuorimateriaalina lähes yhtä hyvin kuin arabikumi. Asiasanat: mikrokapselointi, sumutuskuivaus, antosyaanit, betalaiinit