NUORET TUTKIJAT 2012

Transkriptio

1 NUORET TUTKIJAT 2012 Biokemia Elintarvikekemia Molekulaarinen biotekniikka ja diagnostiikka Biotekniikka DI

2 NUORET TUTKIJAT 2012 Eräsalo Heikki Hänninen Risto Kaataja Ville Kentala Henriikka Kirkham Steven Koskinen Juha Kuusela Erica Laurén Linda Lohermaa Elina Malmi Eeva Mattsson Leena Myllyviita Johanna Mäki-Teeri Petra Nuora Anu Paananen Pasi Punkkinen Matleena Salovaara Oskari Samila Linnea Sipilä Henri Spangar Anni Sundberg Erno Terrijärvi Juho Valkeapää Janne Vuorio Eerika Westhorpe Adam VIIKON AVAUS TIISTAI kello Arcanum Arc1 NUORET TUTKIJAT ESITELMÄSESSIOT TIISTAI PERJANTAI alkaen kello Arcanum Arc1 NUORET TUTKIJAT POSTERINÄYTTELY TIISTAI PERJANTAI Arcanum Ala-aula POSTERISESSIO KESKIVIIKKO Arcanum Ala-aula LOPPUSANAT PERJANTAI kello Arcanum Arc1

3 «I» TIISTAI Viikon avaus Professori Rainer Huopalahti ja tapahtuman isä, dosentti Seppo Sarimo Puheenjohtaja: FT Pekka Rappu «1» Pasi Paananen LanV:n spesifisyyden rakenteellinen perusta BIOKEMIA «2» Linnea Samila SnoaL- ja AknH-entsyymien stereospesifisyyden vaihto BIOKEMIA «3» Eerika Vuorio Glycogen and fermentation product cycling under day and night rhythm in Synechocystis sp. PCC 6803 BIOKEMIA TAUKO 20 minuuttia «II» TIISTAI Puheenjohtaja: FT Saara Wittfooth «4» Heikki Eräsalo Mitochondrial dysfunction and signaling in D. melanogaster human disease model BIOKEMIA «5» Juho Terrijärvi Autofaagisäätelijä ULK1:n (Uncoordinated 51-like kinase) validointi onkologisena kohteena BIOTEKNIIKKA DI «6» Steven Kirkham The development and use of antibody-coated upconverting nanoparticles in cardiac troponin I immunoassay MOLECULAR BIOTECHNOLOGY AND DIAGNOSTICS «7» Adam Westhorpe Development of a time-resolved fluorometric double antigen sandwich assay for the detection of treponemal antibodies MOLECULAR BIOTECHNOLOGY AND DIAGNOSTICS

4 15 05 Biotekniikan alumnin puheenvuoro TkT Johanna Ylikotila, Orion Pharma «III» KESKIVIIKKO Puheenjohtaja: Dos. Pirkko Heikinheimo «8» Henriikka Kentala CLN5-proteiinin tuotto Drosophila-soluissa rakennetutkimuksia varten BIOKEMIA «9» Linda Laurén Ruokavalion vaikutus tulehdusvasteeseen tyypin 1 diabeteksessa BIOKEMIA «10» Elina Lohermaa Elinkykyinen Aggregatibacter actinomycetemcomitans biofilmi sitoo interleukiini-1ß:a BIOKEMIA «11» Johanna Myllyviita c-flip-proteiinin fosforyloinnin vaikutus Th-solujen erilaistumiseen BIOKEMIA Biokemian alumnin puheenvuoro FM Sauli Huopalahti, Orion Pharma POSTERISESSIO KESKIVIIKKO Arcanum Ala-aula Opiskelijat postereidensa äärellä Tarjoilua

5 «IV» TORSTAI Puheenjohtaja: FM Tiina Myyryläinen «12» Henri Sipilä 68Gallium-leimatun PET-merkkiaineen tuotanto: Puhdastilan ja laatukontrollin validointi BIOTEKNIIKKA DI «13» Erno Sundberg GenomEra -reaktiolastutuotannon kehittäminen BIOTEKNIIKKA DI «14» Oskari Salovaara Magnetismia hyödyntävä erottelumenetelmä lantanidiseostetuille upkonvertoiville nanopartikkeleille BIOTEKNIIKKA DI TAUKO 20 minuuttia «V» TORSTAI Puheenjohtaja: FM Mika Kaimainen «15» Petra Mäki-Teeri Kromogeeni- ja fluoresenssivärjäyksen yhdistäminen multispektraalisessa kudoskuvantamisessa androgeenireseptoria ja fosfo-akt:tä mallina käyttäen BIOTEKNIIKKA DI «16» Matleena Punkkinen Akustoforeettinen näytteen esikäsittely PCR:ää varten sepsiksen diagnosoinnissa BIOTEKNIIKKA DI «17» Janne Valkeapää Sian maksan rasva-analyysi osana ylipainoisuustutkimusta ELINTARVIKEKEMIA «18» Anu Nuora Dokosapentaeenihapon (DPA, 22:5n-3) ja eikosapentaeenihapon (EPA, 20:5n-3) aterianjälkeinen aineenvaihdunta ihmisissä ELINTARVIKEKEMIA Elintarvikekemian alumnin puheenvuoro FM Janne Pinta, DHR Finland Oy Innotrac Diagnostics

6 «VI» PERJANTAI Puheenjohtaja: Dos. Urpo Lamminmäki «19» Anni Spangar Monianalyyttimääritys lateraalivirtausalustalla MOLEKULAARINEN BIOTEKNIIKKA JA DIAGNOSTIIKKA «20» Erica Kuusela Dengue-1-viruksen immunodominanttien epitooppien identifiointi faaginäyttötekniikalla MOLEKULAARINEN BIOTEKNIIKKA JA DIAGNOSTIIKKA «21» Eeva Malmi Erotusvapaa troponiinimääritys kelaattikomplementaatiota hyödyntäen MOLEKULAARINEN BIOTEKNIIKKA JA DIAGNOSTIIKKA «22» Juha Koskinen Moniparametrisen antigeenitestin kehitys virtsanäytteille maripoc -testijärjestelmään MOLEKULAARINEN BIOTEKNIIKKA JA DIAGNOSTIIKKA TAUKO 20 minuuttia «VII» PERJANTAI Puheenjohtaja: FM Etvi Juntunen «23» Risto Hänninen Lateral flow -lukijalaitteen prototyypin kehitys BIOTEKNIIKKA DI «24» Leena Mattsson Probioottien elävyyden määritys ATP:n määrään perustuvalla pikamenetelmällä BIOTEKNIIKKA DI «25» Ville Kaataja Riittävätkö painolastivedenkäsittelyjärjestelmien testivaatimukset osoittamaan laitteistojen toiminnan sille tarkoitetussa ympäristössä? BIOTEKNIIKKA DI Loppusanat Professori Heikki Kallio

7

8 «1» LanV:n spesifisyyden rakenteellinen perusta Pasi Paananen Ohjaajat: Ph.D. Laila Niiranen ja FT Mikko Metsä-Ketelä BIOKEMIA Landomysiinit kuuluvat angusykliineiksi nimettyihin aromaattisiin polyketideihin, joita useat streptomykeetit tuottavat sekundaarimetaboliitteinaan. Angusykliineillä on monia bioaktiivisia ominaisuuksia, mutta toistaiseksi niitä ei ole lääkekäytössä joidenkin muiden aromaattisten polyketidien tavoin. Yksi landomysiinien erikoispiirre on C6- hiilen R-stereokemia, jonka muodostumisesta vastaa Streptomyces cyanogenuksen landomysiini-geeniklusterista eristetyn lanv:n geenituote. Tämä lyhytketjuiseksi dehydrogenaasi/reduktaasiksi (SDR) luokiteltu 253 aminohapon entsyymi pelkistää 6- ketoryhmän hydroksyyliryhmäksi. Erikoistyön tärkeimpinä tavoitteina oli selvittää LanV:n kolmiulotteinen rakenne, paikantaa siitä substraatin sitoutumiseen liittyvät alueet, ja selvittää substraatin sitoutumisorientaatio. Näin voitaisiin saada tietoa entsyymin katalysoiman reaktion stereospesifisyyden perustasta. Histidiinihännällisenä tuotettu proteiini puhdistettiin affiniteettikromatografian avulla yksivaiheisesti, ja kiteytettiin LanV:n kofaktorin NADP:n sekä in vitro -tuotteen 11-deoksilandomysinonin kanssa. Lisäksi osa kiteistä kyllästettiin joko 11-deoksilandomysinonilla, tai sen analogilla rabelomysiinillä ennen heijastuskuvien keräystä. Kaikki työn heijastusdata mitattiin European Synchrotron Radiation Facilityssä Grenoblessa Ranskassa. Heijastuskuvien prosessoinnissa käytettiin XDS-ohjelmaa. Vaihekulmat ratkaistiin molekyylinkorvausmenetelmällä, ja rakenteen hienonnus tehtiin CCP4-ohjelmapaketin Refmac5:llä sekä manuaalisesti Cootilla elektronitiheys-karttaan rakentaen. Työssä saatiin selvitettyä kolme LanV-rakennetta: ilman substraattia (1,65 Å), sekä kompleksina 11-deoksylandomysinonin (2,0 Å), ja rabelomysiinin (2,5 Å) kanssa. 11- deoksilandomysinonin tapauksessa näyttäisi siltä, että LanV on katalysoinut reaktionsa taaksepäin kiteessä, sillä saatuun elektronitiheyteen sopi paremmin substraatin 6- ketomuoto. Kaikissa saaduissa rakenteissa oli mukana myös kofaktori NADP. Asiasanat: stereospesifisyys, rakenne, röntgenkristallografia, landomysiinit

9 «2» SnoaL- ja AknH-entsyymien stereospesifisyyden vaihto Linnea Samila Ohjaajat: FT Pauli Kallio ja FT Mikko Metsä-Ketelä BIOKEMIA Streptomyces nogalaterin tuottama SnoaL ja S. galilaeuksen tuottama AknH ovat homologisia entsyymejä, jotka katalysoivat samankaltaisia syklisaatioreaktioita antibioottien biosynteesissä. Ne sulkevat neljännen renkaan nogalamysiini- ja aklasinomysiiniantibioottien biosynteesissä. Molemmat entsyymit voivat käyttää samaa substraattia, nogalonihapon metyyliesteriä (NAME), mutta niiden reaktiotuotteet eroavat stereokemiallisesti. SnoaL:n katalysoima reaktiotuote on nogalaviketoni (C9-S) ja AknH:n auraviketoni (C9-R). Näitä yhdisteitä ei voida suoraan erottaa toisistaan kromatografisesti, mutta ne voidaan erottaa toisistaan käyttämällä RdmE-entsyymiä, joka pystyy 11-hydroksyloimaan auraviketonin mutta ei nogalaviketonia. Tämän työn tarkoituksena oli vaihtaa keskenään entsyymien toisistaan eroavia alueita, jotta voidaan selvittää rakenteellisten erojen vaikutus tuotteiden stereokemiallisen eron muodostumiseen. Lähtökohtana käytettiin DNA-templaatteja, joissa aminohapot 15 ja 51 oli aiemmin vaihdettu entsyymien välillä toisikseen. Entsyymeistä valittiin viisi kohtaa, joiden arveltiin vaikuttavan eniten stereokemialliseen eroon. Näiden kohtien vaihto päittäin tehtiin neljän alukkeen PCR-mutageneesimenetelmällä ja geenit liitettiin E. coli -plasmidiin proteiinituottoa varten. Mutageneesin onnistuminen varmistettiin sekvensoimalla. Puhdistettujen entsyymivarianttien aktiivisuus määritettiin antamalla niiden reagoida NAME:n kanssa ja tämän jälkeen reaktiotuotteiden stereokemia selvitettiin RdmE:n avulla. Muodostuneet yhdisteet analysoitiin korkean erotuskyvyn nestekromatografian (HPLC) avulla. SnoaL-entsyymistä saatiin tehtyä neljä varianttia, mutta AknH-entsyymin mutageneesi osoittautui hankalaksi. Kolmesta onnistuneesta SnoaL-variantista saatiin selville, että niiden katalysoimat reaktiot eivät eronneet natiivista entsyymistä. Tehdyt muutokset eivät yksinään riitä vaihtamaan tuotteen C9-hiilen stereokemiaa toiseksi. Toivotun tuloksen saamiseksi tarvitaan luultavasti ainakin kahden isomman alueen vaihto. Asiasanat: Streptomyces, antibioottien biosynteesi, mutageneesi, nogalamysiini

10

11 «3» Glycogen and fermentation product cycling under day and night rhythm in Synechocystis sp. PCC 6803 Eerika Vuorio Supervisors: Ph.D. Pauli Kallio and Ph.D. Patrik Jones BIOCHEMISTRY Some cyanobacteria are able to produce energy storing compounds during the energy rich day time and utilize them during the dark anoxic period through a fermentative metabolism. This kind of day and night cycle has not yet been studied with Synechocystis sp. PCC 6803 in which for example oxygen sensitive nitrogen fixation is temporally separated from light dependent photosynthesis. Byproduct in nitrogen fixation is hydrogen which is a highly potential biofuel. The first part of the study was to find out if Synechocystis sp. PCC 6803 can accumulate glycogen during the day period and use it during the dark period. Cells were grown with different carbon sources under continuous cycling of 16 hour day and 8 hour dark period and a control was grown under constant light. One of the carbon sources was acetate, which is one of the potential fermentation products. Growth was followed by measuring both OD 750 and chlorophyll A concentration. Samples were taken just before the dark period and just before the light period to measure the glycogen content. Glycogen was quantified with a commercial kit. The other part of the study was to find out what fermentation products Synechocystis sp. PCC 6803 produces when grown anoxic with glucose under darkness. Growth was followed and compared to identical culture in the presence of air. Samples were taken at the beginning of the experiment and after the growth had reached the stationary phase. Samples will be analyzed with GC-MS. The cells grew almost as fast under the day and night conditions as under the constant light. In fact they don t grow at all during the dark phase but during the light phase they grow even faster than the controls grown under constant light. When acetate was an extra carbon source (with bicarbonate) cells grew slightly faster than with just bicarbonate or acetate. Preliminary results suggest that glycogen is accumulated during the day time and dissipated during the dark phase, but differences are very small. And there are bigger differences in glycogen concentration under constant light cultures. The fermentation products have not yet been identified. Keywords: Day and night rhythm, glycogen, fermentation products

12 «4» Mitochondrial dysfunction and signaling in D.melanogaster human disease model Heikki Eräsalo Supervisors: M.Sc. Esko Kemppainen and prof. Howard Jacobs BIOCHEMISTRY The tko 25t model suffers from impaired mitochondrial protein synthesis due to a point mutation in the tko gene which is necessary for mitoribosome assembly. This causes a phenotype closely resembling some human mitochondrial disease with symptoms like developmental retardation, susceptibility to paralytic seizures and muscle weakness. Mitochondrial dysfunction was found to cause a transcriptional response in tko 25t mutants which leads to rearrangements in metabolic pathways and upregulation of catabolism. This is thought to help the organism to cope with defective mitochondria. The aim of this study is to find out signaling pathways involved in mediating this transcriptional response. To study the transcriptional response, we produced transgenic egfp reporter lines which share the promoters of the genes whose upregulation is part of the transcriptional response and by measuring egfp activity we can measure promoter activity also. The genes under study are ImpL3 (lactate dehydrogenase), Fbp1 (nutrient storage protein) and CG17192 (gut lipase). We're also implementing RNAi technology targeted against some well characterized stress responsive pathways such as FOXO, AMPK and JNK. Then the effect of knockdown on fly viability, development, transcriptomics and reporter genes can be assessed with different techniques like qpcr, western blotting and developmental time assays. By measuring the transcript levels of the egfp reporters and comparing them to the expression levels of the corresponding endogenous gene, we have been able to postulate that ImpL3 and Fbp1 are under tight promoter level regulation whereas the promoter of CG17192 does not appear to be a significant regulatory measure. We also have preliminary evidence that especially AMPK and JNK mediated signaling could play a significant role in tko 25t mutants since knockdown appears to be lethal to the mutants. FOXO might also be involved but doesn't seem to be as an important factor as AMPK or JNK. Low level of FOXO knockdown wasn't lethal but it didn't appear to produce a definitive transcriptomal effect either. Keywords: Mitochondrial dysfunction, cell signaling, gene regulation, D.melanogaster

13 Onks maailmas mittä hullumpa, ku tilat oligoit ulkomailt ja maksa rahti, laskutukse ilost ja viel starttei ja sen sellast. Tila Oligomerist ni et maksa ku oligost! Näi totte Oligomeri väki. Melkein turkulaisia oligoja vuodesta

14 «5» Autofaagisäätelijä ULK1:n (Uncoordinated 51-like kinase) validointi onkologisena kohteena Juho Terrijärvi Ohjaajat: FM Mari Peltola ja Ph.D. Vladimir Kirkin BIOTEKNIIKKA DI Autofagia tarkoittaa solujen itsesyöntiä ja se on evoluutiossa säilynyt keino käyttää solun omia metaboliatuotteita sisäisenä energianlähteenä nääntymyksen ja stressin aikana. Solut käyttävät autofagiaa myös keinona muokata itseään ja tapana hävittää viottuneita proteiineja ja solun osia. ULK1 (Uncoordinated 51-like kinase) on nisäkkäiden autofagian tärkeä säätelijä, joka aloittaa autofagosomien muodostamiseen johtavan ketjureaktion. Diplomityö tehtiin Merck-Seronolle ja sen tavoitteena oli tutkia autofagiaa syöpäterapiassa estämällä ULK1n toiminta. Tätä tarkoitusta varten ULK1n hiljentäminen proteiinitasolla optimoitiin käyttämällä sirna (small interfering RNA) tekniikkaa Western blotin avulla. LC3n (light chain 3 beta of rat microtubuleassociated protein 1) avulla voidaan nähdä estynyt autofagia, koska LC3n lipidaatiota ei pitäisi tapahtua, kun autofagia on poissa päältä. Tällöin ULK1n hiljentämisen vaikutus tulisi näkyä Western blotilla LC3n lipidoidun muodon poistumisena. Geenin hiljentämisen vaikutusta tutkittiin myös konfokaalimikroskoopilla. Syöpäsolujen jakaantumista ja selviytymistä tutkittiin yhdistämällä ULK1n hiljentäminen syöpälääkkeillä aiheutettuun terapeuttiseen ja näännytyksellä aiheutettuun metaboliseen stressiin. ULK1 homologin ULK2:n sekä ATG7:n, joka on toinen tärkeä geeni autofagiassa, hiljentämistä ja sen vaikutusta autofagiaan tutkittiin myös verrataksemme työtä kirjallisuudessa esitettyihin tuloksiin. ULK1n hiljentämisen huomattiin estävän autofagian: se esti autofagosomien muodostumisen ja aiheutti soluihin ubikitiinia sisältävien proteiiniaggreosomien muodostumisen. Normaaleissa kasvuolosuhteissa ULK1-geenin hiljentäminen ei aiheuttanut solukasvua hidastavaa vaikutusta eikä estänyt pesäkkeiden muodostumista, kuten ei myöskään ULK2n tai ATG7n hiljentäminen. Kuitenkin terapeuttisen tai metabolisen stressin huomattiin vaikeuttavan solujen selviytymistä ja kasvua ULK1n ollessa hiljennetty, kuten myös vähemmässä määrin ULK2n tai ATG7n. Saadut tulokset tukevat ULK1n hiljentämisen käyttämistä keinona syöpäterapiassa. Asiasanat: Uncoordinated 51-like kinase; autofagia; syöpä; onkologinen kohde; metabolinen stressi; terapeuttinen stressi

15 «6» The development and use of antibody-coated upconverting nanoparticles in cardiac troponin I immunoassay Steven Kirkham Supervisors: M.Sc. Riikka Arppe and M.Sc. Marja-Leena Järvenpää MOLECULAR BIOTECHNOLOGY AND DIAGNOSTICS Luminescent upconverting nanoparticles (UCNPs) are around nm in diameter and consist of an inorganic crystalline lattice (e.g. NaYF4) with embedded lanthanide ions (e.g. Yb 3+ and Er 3+ ). They have a unique ability to emit at a higher energy visible light when exposed to lower energy infrared (IR) light in a process called anti-stokes emission. This gives them the advantage over conventional fluorophores that they avoid autofluorescence. However, small particle size creates problems in the surface coating process as previous washing methods, such as centrifugation, can no longer be used due to the poor yield of the particles. This work has focused upon optimising the antibody coating of the UCNPs and then utilising these coated UCNPs as labels in a cardiac troponin I (ctni) immuno-assay. Prior to antibody coating, the UCNP surface was activated through silanisation and carboxylation. Thereafter, the anti-ctni antibody was covalently coupled to the surface by attaching the amino groups on the antibody to the carboxyl groups on the UCNP. The conjugation conditions, the amount of antibody, and the washing steps of the reaction were optimised to improve the binding capacity and yield. Two different sized filter tubes (300k and 100k) and also a new magnetic separation method were tested. Heterogeneous ctni assay was then used to determine UCNP signal strength, signal to background ratio, sensitivity, and non-specific binding. The highest yield of antibody-coated UCNPs was obtained with the 100k filter (around 100%). The magnetic separation method and 300k filter gave much lower yields (29% and 21%, respectively). In the ctni assay, all samples gave a dose related response. However, the sensitivity and dynamic range were not adequate, due to high non-specific binding. Thus further improvements, such as more efficient blocking of the particle surface and optimisation of the buffer contents, are needed to increase UCNP functionality. Keywords: upconversion, nanoparticle, cardiac troponin I, immunoassay

16 Nuoria tutkijoita tukemassa hillot ja mehut suomalaisista marjoista Marjajaloste Meritalo Oy, Makarlantie 45, Ylönkylä, Salo, ,

17 «7» Development of a time-resolved fluorometric double antigen sandwich assay for the detection of treponemal antibodies Adam Westhorpe Supervisor: Ph.D. Sheikh Mohd Talha MOLECULAR BIOTECHNOLOGY AND DIAGNOSTICS Treponema pallidum, the spirochete responsible for syphilis infection, is a health concern worldwide, especially in developing countries. In 2008, the WHO recorded nearly 100,000 deaths worldwide from syphilis infection. Treponemal and nontreponemal antibodies become detectable in the body following infection. Nontreponemal antibodies are raised against cardiolipin, a lipid molecule that is elevated in the blood following treponemal infection. Following infection, T. pallidum specific IgM molecules, later followed by IgG molecules, are released and circulated in the blood. These treponemal antibodies are specific for epitopes on the bacteria; IgM molecules indicate acute infection, whereas IgG molecules can be present in both an acute or convalescent infection. There are several EIA or agglutination based detection kits currently available on the market for detection of treponemal antibodies- our aim is to develop a highly sensitive but inexpensive assay for the detection of treponemal antibodies. The double-antigen sandwich assay that we are developing allows detection of total (IgG and IgM) antibodies against Treponema. Two assay formats were developed, in which a biotinylated recombinant (r-) p fusion protein was used as a capture antigen, and either Europium chelate-labeled r-fusion protein or r-fusion protein coated on Europium chelate-doped nanoparticles were used as tracer antigens for detection of antibodies using time resolved fluorometry (TRF). The long lifetime of fluorescence of Europium enables TRF measurement of the signals, which significantly reduces the background fluorescence. These assays were initially optimized with Treponema-immunized rabbit serum as a model analyte, and then tested using Treponema positive and negative human serum samples. From these preliminary results, both assays seem to be very sensitive, although they need further evaluation with a larger number of samples. Keywords: Syphilis, recombinant fusion proteins, immunoassay, Europium chelate, time-resolved fluorescence

18 «8» CLN5-proteiinin tuotto Drosophila-soluissa rakennetutkimuksia varten Henriikka Kentala Ohjaajat: FT Elise Pinta ja FT dos. Pirkko Heikinheimo BIOKEMIA Neuronaaliset seroidilipofuskinoosit (engl. Neuronal Ceroid Lipofuscinoses, NCL) ovat harvinaisia perinnöllisiä lysosomaalisia kertymäsairauksia, joissa elimistön kudoksiin, mm. hermokudokseen kertyvät lipopigmentit (lipofuskin) aiheuttavat aivojen rappeutumista. NCL-tyypit luokitellaan sen mukaan, missä geenissä mutaatio sijaitsee. Tyypin 5 NCL:n tiedetään johtuvan CLN5-geenin mutaatiosta, mutta CLN5-proteiinin luonnollista tehtävää soluissa ei tunneta. CLN5:n on kuitenkin havaittu vuorovaikuttavan muiden CLN-proteiinien, mm. CLN1:n kanssa. CLN5-proteiinin kolmiulotteisen rakenteen määrittäminen olisi sen toiminnan selvittämisen kannalta tärkeä saavutus. Ihmisen liukoista CLN5-proteiinia tuotettiin Drosophilan Schneider2-soluissa. Tuottoplasmidissa oli signaalisekvenssi, jonka ansiosta syntetisoitunut liukoinen CLN5- proteiini kuljetettiin soluista ulos soluja ympäröivään kasvatusmediumiin. Lisäksi proteiinin N-terminuksessa oli puhdistusta helpottava Strep II Tag. CLN5-proteiinin tuottoa varten valmistettiin pysyvä solulinja, minkä lisäksi proteiinia tuotettiin transientilla transfektiolla. Tuoton tehokkuutta testattiin indusoimalla soluja eri solutiheyksissä ja transfektoimalla transientisti yhdessä CLN1-proteiinin kanssa. Lisäksi testattiin, voitiinko pysyvässä solulinjassa tuottaa proteiinia seerumittomassa kasvatusmediumissa. Proteiinin tuottotasojen vertailuun käytettiin western-blottausmenetelmää ja puhdistukseen affiniteettikromatografiaa. Kokeissa havaittiin, että proteiini tuottuu liukoisena solun ulkopuolelle molemmissa solulinjoissa. Paras tuotto saavutettiin, kun transfektoitiin transientisti ja indusoitiin alhaisessa solutiheydessä (1 2 milj. solua / ml). Toisaalta transientissa transfektiossa CLN5:n ilmentäminen yhdessä CLN1:n kanssa ei vaikuttanut proteiinin tuottotasoon. Tuottunut CLN5 saatiin eristettyä kasvatusmediumista affiniteettikromatografian avulla. Asiasanat: Neuronaalinen seroidilipofuskinoosi, CLN5, Drosophila-tuotto, transientti transfektio, pysyvä solulinja, tuottotaso, western-blottaus

19

20 «9» Ruokavalion vaikutus tulehdusvasteeseen tyypin 1 diabeteksessa Linda Laurén Ohjaajat: FT Raine Toivonen ja LT Arno Hänninen BIOKEMIA Tyypin 1 diabetes (T1D) on yleinen sairaus Suomessa ja sen esiintyvyys on lisääntynyt vuosittain maailmanlaajuisesti. T1D:ssä haiman Langerhansin saarekkeiden insuliinia tuottavat -solut tuhoutuvat autoimmuuniluonteisesti. Haima on suoraan yhteydessä ruuansulatuskanavaan, ja suolen immuunisysteemin oletetaankin liittyvän T1D:n syntyyn. Erikoistyössä tarkastellaan haiman ja suolen immuunivasteiden mahdollista yhtenevyyttä T1D:n hiirimallilla. Ruokavaliotekijöiden uskotaan vaikuttavan T1D:n syntyyn yhdessä suolen bakteerikannan kanssa. Erikoistyössä tutkitaankin T1D:ltä suojaavaksi mielletyn ruokavalion vaikutusta haiman ja suolen immuunivasteeseen. Immuunivastetta pyritään kuvaamaan CD4 + T-lymfosyyttivasteeseen liittyvillä sytokiineillä ja transkriptiotekijöillä. Työssä käytettiin T1D:n tautimallia NOD-hiirtä (nonobese diabetic), jolle diabetes kehittyy spontaanisti. Kontrolliruokavaliolla ja vähemmän viljaa sisältävällä erikoisruokavaliolla ruokituilta seitsenviikkoisilta hiiriltä kerättiin haima, ohutsuolen loppuosa ja paksusuoli. Haimasaarekkeet erotettiin muusta haimakudoksesta laser microdissection -menetelmällä (LMD) ja ohutsuolen loppuosa ja paksusuoli homogenoitiin. Haimasaareke- ja suolinäytteistä eristettiin RNA:ta kudosmäärille sopivilla menetelmillä. RNA:sta syntetisoitiin cdna:ta, jonka eheys tarkistettiin housekeeping-geenin PCR:llä. cdna:sta määritettiin sytokiineja ja transkriptiotekijöitä näille spesifisillä alukkeilla kvantitatiivisella reaaliaikaisella PCR:llä (Q-RT-PCR). Alustavan tarkastelun perusteella haimasaarekkeiden sekä ohut- ja paksusuolen sytokiiniprofiilien samankaltaisuus viittaa yhteyteen elinten välillä. Tutkimusryhmä on ennen todennut vähemmän viljaa sisältävän ruokavalion vähentävän T1D:n esiintyvyyttä NOD-hiirillä. Erikoistyön alustavat tulokset viittaavatkin erikoisruokavalion T1D:ltä suojaavaan vaikutukseen. Asiasanat: tyypin 1 diabetes, ruuansulatuskanava, Q-RT-PCR, LMD, sytokiiniprofiili

21 «10» Elinkykyinen Aggregatibacter actinomycetemcomitans biofilmi sitoo interleukiini-1ß:a Elina Lohermaa Ohjaajat: FM Annamari Paino ja FT Riikka Ihalin BIOKEMIA Biofilmiä muodostava gram-negatiivinen Aggregatibacter actinomycetemcomitans on tärkeä aggressiivisen parodontiitin eli hampaan kiinnityskudosten tulehduksen aiheuttaja. Keskeinen tulehduksenvälittäjäaine interleukiini (IL)-1ß edistää solujen proliferaatiota terveessä hammasta ympäröivässä kudoksessa. Työn tavoitteena oli karakterisoida IL-1ß:n sitoutumista A. actinomycetemcomitans biofilmiin sekä tutkia biofilmin vaikutusta epiteelisolujen proliferaatioon organotyyppisessä ienkudosmallissa. Toinen tavoite oli tunnistaa mahdollinen bakteerin ulkokalvolla sijaitseva reseptori, joka osallistuu IL-1ß:n kuljettamiseen solun sisälle. Työssä käytettiin ienkudosta jäljittelevää kudosviljelymallia, joka koostui ikenen fibroblasti (HGF)-kollageeni matriksista ja keratinosyyteistä (HGK). Kudosmallia ärsytettiin A. actinomycetemcomitans biofilmillä antibioottien (penisilliini ja streptomysiini) kanssa sekä ilman antibiootteja. Antibioottien vaikutusta biofilmin elinkykyisyyteen arvioitiin fluoresoivilla väriaineilla (LIVE/DEAD) käyttäen konfokaalimikroskopiaa sekä kristalliviolettivärjäyksellä. IL-1ß:n sijaintia biofilmissä tarkasteltiin immunoelektronimikroskopialla jääleikkeistä. Lisäksi parafiinileikkeistä tutkittiin HGK-solujen proliferaatiota Ki-67 värjäyksellä. Bakteerin ulkokalvoproteiinifraktiosta pyrittiin tunnistamaan mahdollinen IL-1ß reseptori käyttämällä pull-down menetelmää ja massaspektrometriaa. Antibioottiyhdistelmä vähensi biofilmin elinkykyisyyttä, ja IL-1ß:n havaittiin kulkeutuvan vain elävien A. actinomycetemcomitans solujen sisälle. HGK-solujen proliferaatio väheni elävän biofilmin kanssa inkuboitaessa. Sitomalla tehokkaasti keskeistä tulehduksenvälittäjäainetta IL-1ß:a A. actinomycetemcomitans biofilmi saattaa häiritä isännän paikallista puolustusvastetta sekä mahdollisesti estää epiteelisolujen proliferaatiota. Tämän vuorovaikutuksen osoittamiseksi pitäisi tunnistaa bakteerin ulkokalvon IL-1ß reseptori, jotta pystyttäisiin valmistamaan spesifisiä mutantteja tutkimuksia varten. Asiasanat: Aggregatibacter actinomycetemcomitans, interleukiini (IL)-1ß, parodontiitti, epiteelisolujen proliferaatio

22

23 «11» c-flip-proteiinin fosforyloinnin vaikutus Th-solujen erilaistumiseen Johanna Myllyviita Ohjaajat: FM Minna Kyläniemi ja prof. Riitta Lahesmaa BIOKEMIA T-auttajasolut (Th-solut) ovat tärkeä osa ihmisen immuunipuolustusta. Th-solut jakautuvat ainakin kahdeksi alaluokaksi: Th1- ja Th2-soluiksi. Erilaistuminen riippuu mm. solun kohtaamista sytokiineista, joista tärkeimpiä ovat Th1-soluiksi ohjaava Interleukiini 12 (IL12) sekä Th2-soluiksi ohjaava IL4. Myös kaspaasiaktiivisuudella on todettu olevan merkitys Th-solujen erilaistumisessa. Kaspaasi-8 proteiinin aktiivisuuden estämisen on todettu lisäävän Th2-solujen tuottaman IL4:n määrää ja Th2-solujen erilaistumista. Kaspaasiaktiivisuutta säätelevät monet tekijät mm. c-flip (engl. cellular FLICE inhibitory protein) proteiinin eri isomuodot, joita on kolme: lyhyt (engl. c- FLIPshort, c-flips), pitkä (engl. c-flip long, c-flipl) ja raji (c-flipr). c-flips proteiinin ilmeneminen lisääntyy IL4:n vaikutuksesta ja sen on todettu estävän myös kaspaasi-8:n aktiivisuutta. c-flips:n stabiilisuutta säädellään proteiinin fosforylaation avulla. Erikoistyön tarkoituksena oli tutkia c-flip proteiinin lyhyen muodon fosforylaation vaikutusta Th-solujen erilaistumiseen. Proteiinista on tehty kaksi mutaatiota, jotka villityypin proteiinin lisäksi on kloonattu plasmidiin, joka ilmentää myös H2Kmolekyylin DNA:ta. Tehty mutaatio aiheuttaa joko c-flips proteiinin stabiloitumisen tai epästabilisoitumisen imitoiden proteiinin fosforyloinnin vaikutusta. H2K on hiiren typistetty MHCI-molekyyli, jota ilmennetään solun pinnalla ja jota voidaan käyttää transfektoituneiden solujen erottamiseen. Työssä CD4+ T-auttajasolut eristettiin periferaalisesta verestä ja transfektoitiin elektroporaatioon perustuvalla Amaxan nukleofektio-menetelmällä. Transfektoidut solut ohjattiin erilaistumaan joko Th1- tai Th2-soluiksi. Transfektoituneiden Th-solujen erilaistumista tutkittiin virtaussytometrian, reaali-aikaisen RT-PCR:n ja western blot-menetelmän avulla. Transfektiotehokkuudeksi saatiin n % elävistä soluista. Solujen erilaistumista tutkittiin käyttäen erilaisia erilaistumismarkkereita, kuten IFN (Th1-solut) tai IL4 (Th2-solut). Tuloksia saatiin kahdesta erillisestä solukasvatuksesta, mutta ne eivät olleet toistensa kanssa kovin yhteneviä. Alkuperäisen hypoteesin mukaan oletettiin, että c- FLIPs proteiinin stabiloiva mutaatio ohjaa soluja enemmän Th2-suuntaan kuin epästabiili mutaatio. Tutkimushypoteesin varmistamiseksi tarvitaan vielä lisätutkimuksia. Asiasanat: Th-solut, erilaistuminen, c-flip

24 «12» 68Gallium-leimatun PET-merkkiaineen tuotanto: Puhdastilan ja laatukontrollin validointi Henri Sipilä Ohjaajat: prof. Anne Roivainen, FM Pauliina Luoto ja FT Harri Takalo BIOTEKNIIKKA DI Positroniemissiotomografia (PET) on isotooppikuvantamisen muoto, joka perustuu positronisäteilijöiden käyttöön merkkiaineena. Positroneja emittoiva radionuklidi liitetään biologisesti aktiiviseen yhdisteeseen kemiallisella synteesillä. Valmis tuote, radiolääkeaine, annostellaan potilaan verenkiertoon ja sen kulkeutumista elimistössä seurataan PET-kameralla. Kliiniseen käyttöön tarkoitettujen radiolääkeaineiden tuotanto täytyy suorittaa validoidussa puhdastilassa ja lopputuotteen laadunvarmistus on suoritettava validoiduilla menetelmillä. Työssä esiintyvät radiolääkeaineet ovat [ 68 Ga]DOTATOC ja [ 68 Ga]DOTANOC, jotka kohdentuvat esimerkiksi neuroendokriinisissa kasvaimissa ilmentyviin somatostatiinireseptoreihin. [ 68 Ga]radiolääkkeiden tuotantoa varten olemassa oleva laboratorio muutettiin C-luokan (GMP) puhdastilaksi siten, että se täyttää myös säteilyturvakeskuksen B-luokan radionuklidilaboratorion vaatimukset. Tilan validointia varten laadittiin validointisuunnitelma. Validointi suoritettiin puhdastiloihin erikoistuneen yrityksen toimesta. Lopputuotteen laadunvarmistuksen osalta laadittiin validointisuunnitelmat Kromatografisille menetelmille (HPLC- ja TLC), suoritettiin validoinnit ja kirjoitettiin validointiraportit. Lisäksi kirjoitettiin ohjeet tasaisin väliajoin suoritettavaan 68 Ge/ 68 Gageneraattorin eluaatin laadunvalvontaan. Puhdastila täytti validointisuunnitelmassa esitetyt vaatimukset ja se voitiin ottaa käyttöön. Kromatografisten laadunvarmistusmenetelmien validoinnissa osoitettiin, että menetelmät toimivat niille osoitettussa tarkoituksessa ja tuottavat toistuvasti oikeita tuloksia. Myös generaattorin eluaatille asetetut laatuvaatimukset ovat toistaiseksi täyttyneet. Näiden tulosten perusteella menetelmät voitiin ottaa käyttöön osana [ 68 Ga]radiolääkeaineiden kliinisen tuotannon laatukontrollia. Asiasanat: PET, DOTATOC, DOTANOC, 68Gallium, HPLC, TLC

25

26 «13» GenomEra -reaktiolastutuotannon kehittäminen Erno Sundberg Ohjaajat: FM Tom Palenius, Abacus Diagnostica Oy, Turku ja FM Ari Lehmusvuori BIOTEKNIIKKA DI Työn aiheena oli kehittää GenomEra -reaktiolastujen tuotantoa. Nykyinen reaktiolastutuotanto pohjautuu pitkälti tuotekehityksen aikaisiin menetelmiin. Pienten tuotanomäärien takia tuotantoa ei ole aikaisemmin laajamittaisesti analysoitu. Tuotantomäärien kasvaessa nykyisten menetelmien rajoitukset on kuitenkin syytä tietää, jotta mahdollisiin tuotannon laajennuksiin osataan varautua riittävän ajoissa. Työn tavoitteena oli tunnistaa nykyisen tuotanprosessin ongelmakohdat ja löytää niihin ratkaisuja tuotantokapasiteetin kasvattamiseksi kustannustehokkaasti. Työn aluksi kuvattiin tuotantoprosessi ja tehtiin nykytila-analyysi, jossa selvitettiin eri osaprosessien materiaali- ja työvoimakustannukset. Kuvattu tuotantoprosessi jaettiin toimintoihin, joita käytettiin nykytila-analyysissä. Työssä selvitettiin myös tuotannon nykyinen kapasiteetti ja kapasiteettia rajoittavat työvaiheet, eli pullonkaulat. Työssä tutkittiin eri työvaiheiden automatisointimahdollisuuksia ja laskettiin automaation hyödyt niin kapasiteetin kuin kustannustehokkuudenkin kannalta tietyille toiminnoille. Tuotantoprosessi eriteltiin työvaiheisiin, puolivalmisteisiin, eräkohtaisiin puolivalmisteisiin, ja ostomateriaaleihin. Työvaiheet jaettiin eri toimintoihin, joille määritettiin kapasiteetit. Tuotannon nykykapasiteetti määritettiin eri toimintojen kapasiteettien perusteella testiin vuodessa. Tuotannon pullonkaulaksi havaittiin testilastujen merkitseminen, eli etiketöinti. Etiketöinnin osuus kokonaistyöajasta on 18 % ja tilarajoitteiden takia henkilöstöä ei ole mahdollista lisätä. Merkintä on kuitenkin mahdollista automatisoida kohtuullisin kustannuksin, jolloin ilman suurempia prosessimuutoksia kapasiteetti voidaan kaksinkertaistaa eräkokoa kasvattamalla. Eräkoon kasvattamisella myös kustannustehokkuus paranee, sillä eräkoosta riippumattomien asetusaikojen suhteellinen osuus työajasta vähenee. Asiasanat: kapasiteetti, kustannustehokkuus, nykytila-analyysi, tuotantoprosessi

27 «14» Magnetismia hyödyntävä erottelumenetelmä lantanidiseostetuille upkonvertoiville nanopartikkeleille Oskari Salovaara Ohjaajat: FT Terhi Riuttamäki, FM Riikka Arppe ja prof. Tero Soukka BIOTEKNIIKKA DI HGMS (engl. high gradient magnetic separation) on tekniikka, jossa ulkoisen magneettikentän avulla erotellaan magneettisia materiaaleja ei-magneettisista. Tyypillisesti eroteltavat materiaalit ovat pieniä partikkeleita ja HGMS-tekniikan avulla esimerkiksi kaivosteollisuudessa erotellaan magneettisia malmeja kaivoslietteestä. Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli rakentaa HGMS-laitteisto, tutkia sen toimintaa eri ratkaisuja soveltaen sekä testata sen suorituskykyä puhdistettaessa lantanidiseostettuja upkonvertoivia nanopartikkeleita. HGMS-tekniikassa käytettävä magneettivuon tiheys on yleensä suuri (vähintään 1 T) ja sitä voidaan suurentaa paikallisesti jopa yli kertaa suuremmaksi lisäämällä magneettikenttään magnetisoituvasta materiaalista tehty matriisi, jonka läpi eroteltavat partikkelit johdetaan suspensiona. Matriisimateriaalina käytetään yleensä ferromagneettisia jauheita, partikkeleita, verkkorakenteita tai villoja. Kun ulkoinen magneettikenttä poistetaan, voidaan sitoutuneet partikkelit huuhtoa pois matriisista. Luminoivat upkonvertoivat nanopartikkelileimat sisältävät molekyylirakenteessaan lantanideja, jotka ovat luonnostaan paramagneettisia. Tämä mahdollistaa HGMStekniikan käytön eroteltaessa lantanideja sisältäviä nanopartikkeleita muista materiaaleista esimerkiksi niitä pinnoitettaessa ja konjugoitaessa biomolekyyleihin. Käytetyn laitteiston toiminta perustui neodyymikestomagneetteihin, joilla saatiin tarvittaessa muodostettua yli 1 T magneettikenttä. Matriisi oli pakattuna putkeen, jonka pituutta voitiin säätää tarpeen mukaan. Tutkimuksen keskeisenä tuloksena kokeellisesti osoitettiin, että HGMS-tekniikalla voidaan erotella lantanidiseostettuja upkonvertoivia nanopartikkeleita muista materiaaleista. Tekniikalla pystytään tietyissä olosuhteissa saavuttamaan jopa yli 90 % saanto. Matriisimateriaaliksi valittiin ominaisuuksien ja saatavuuden perusteella ruostumaton teräsvilla. Menetelmän erottelukapasiteettiin voidaan vaikuttaa lisäämällä matriisia, hidastamalla virtausnopeutta ja kasvattamalla magneettikentän voimakkuutta, mutta kapasiteetin suurentaminen vaatii vielä lisätutkimuksia. Asiasanat: nanopartikkelit, magnetismi, lantanidit, HGMS

28

29 «15» Kromogeeni- ja fluoresenssivärjäyksen yhdistäminen multispektraalisessa kudoskuvantamisessa androgeenireseptoria ja fosfo-akt:tä mallina käyttäen Petra Mäki-Teeri Ohjaajat: FT Teijo Pellinen ja FM Riina-Minna Väänänen BIOTEKNIIKKA DI Aktiivisella androgeenireseptorilla (AR) on merkittävä vaikutus eturauhassyöpäsolujen kasvuun. Eturauhassyöpää hoidetaankin estämällä androgeenien sitoutuminen kohdereseptoriinsa, mutta tästä huolimatta joissakin tapauksissa syöpä uusiutuu. Yksi hypoteesi on, että myös fosfo-akt (pakt) pystyy aktivoimaan AR:n. Tutkimuksen tarkoituksena on multispektraalikuvantamisen avulla tutkia AR:n, p-akt:n ja aktiivisen AR:n säätelemän prostataspesifisen antigeenin (PSA) ilmentymistä eturauhassyövässä. Multispektraalisessa kuvantamisessa tutkittavasta näytteestä havaittavan valon intensiteettiä mitataan usealla eri aallonpituudella. Kun näytteen eri komponenttien spektrit tiedetään, pystytään algoritmien avulla tästä koko näytteen intensiteettijakaumasta erottelemaan yksittäisten komponenttien intensiteetit. Työssä käytettiin monikudosleikkeitä, joissa samalla lasilla oli 50 formaliini-fiksattua parafiiniin valettua eturauhassyöpäkudosnäytettä. Tutkittavat proteiinit tunnistettiin niille spesifisten vasta-aineiden avulla ja detektoitiin lajispesifisillä sekundäärivastaaineilla, joihin oli liitetty entsyymi tai fluoresoiva kvanttipiste (Qdot). AR:n tai pakt:n punaisen entsyymireaktion kehittämisen jälkeen kudosta lämpökäsiteltiin mikroaaltouunissa, jolloin sitoutuneet vasta-aineet denaturoituivat värireaktion katoamatta. Tämän jälkeen näytteet pystyttiin värjäämään toisella samassa eläimessä tuotetulla vasta-aineella. PSA detektoitiin vihreällä kromogeenillä ja sytokeratiini 8 (CK8) fluoresoivalla Qdot705:lla. CK8:n avulla erotettiin analysoitavat epiteelisolut ja näiden joukossa olevat karsinoomasolut ympäröivästä stroomasta. Kudosnäytteet kuvattiin multispektraalikameralla ja spektrien erottelu tehtiin Nuance 3.0-ohjelmalla. Työssä pystyttiin onnistuneesti erottelemaan kaksi kromogeenisignaalia sekä yksi fluoresenssisignaali toisistaan. Koska nämä signaalit ovat verrannollisia tutkittavien proteiinien pitoisuuteen, pystyimme multispektraalisesti mittaamaan kolmen proteiinin ilmenemistä yhdestä leikkeestä. Näiden tulosten avulla voimme tutkia tarkemmin AR:n ja pakt:n vuorovaikutusta eturauhassyövässä. Asiasanat: multispektraalinen kuvantaminen, immunohistokemia, AR, pakt

30 «16» Akustoforeettinen näytteen esikäsittely PCR:ää varten sepsiksen diagnosoinnissa Matleena Punkkinen Ohjaajat: FM Ari Lehmusvuori, FM Maria Nordin, FT Pelle Ohlsson ja FT Saara Wittfooth BIOTEKNIIKKA DI Sepsis eli verenmyrkytys on vakava tila, jossa kehoon syntyy siihen tunkeutuneiden mikrobien takia systeeminen tulehdusvaste (SIRS). Se on yleisin sydäntautiyksiköiden ulkopuolella tapahtuvien sairaalakuolemien syy. Koska kuolleisuus kasvaa hoidon aloituksen viivästyessä 5-10 % tuntia kohti, on sepsiksessä tärkeää nopea diagnoosi, mutta tähänastiset tunnistusmenetelmät ovat joko puhtaasti oireiden arviointiin perustuvia ja siten suhteellisen epäluotettavia, tai hitaita ja silti kykenemättömiä tunnistamaan kaikkia mikrobeja. Lisäksi hoidon aloitus ilman diagnoosia johtaa laajakirjoisten antibioottien käyttöön, jolloin syntyy resistenttejä kantoja. Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli kehittää nopeaa, näytteen esikäsittelyvaiheessa akustoforeesia hyödyntävää ja PCR:ään perustuvaa sepsiksen diagnoosimenetelmää bakteerien tunnistamiseksi verestä. Mallibakteerina käytetyn Escherichia colin detektointiin ja kvantifioitiin käytettiin reaaliaikaista polymeraasiketjureaktiota (q- PCR). Jotta bakteerit pystyttäisiin tunnistettamaan verestä, punasolut pyrittiin poistamaan akustoforeesilla. Akustoforeesissa käytetään seisovia ultraääniaaltoja virtaavassa nesteessä olevien partikkelien konsentroimiseen ja ohjaamiseen. Tämä tehdään akustoforeesilastussa, jossa kanavat ovat muutaman sadan mirometrin levyisiä ja nesteen virtaus laminaarista. PCR monisti E. coli -bakteereita odotetusti. Pienillä pitoisuuksilla veren komponenteista plasma ja punasolut eivät häirinneet PCR-määritystä. Akustoforeesissa pystyi pienillä veripitoisuuksilla erottamaan punaiset verisolut bakteereista, joskin osa bakteereista vaikuttaisi kulkeutuvan punaisten verisolujen mukana ja osa niistä menetetään esimerkiksi putkiin tarttuneina. Tällä hetkellä menetelmän kehittämisen kannalta ongelmallista on, ettei laimentamatonta verta voida ajaa akustoforeesissa ilman, että punasolut vetävät nestettä ja sen mukana bakteereita mukanaan. Lisäksi tutkimustietoa tarvitaan muiden bakteerien kuin E. colin sekä tiettyjen veren komponenttien, erityisesti verihiutaleiden, käyttäytymisestä akustoforeesissa. Akustoforeesi vaatii optimointia, jotta mahdollisimman pieni osuus bakteereista menetetään. Avainsanat: sepsis, akustoforeesi, PCR, diagnosointi

31

32 «17» Sian maksan rasva-analyysi osana ylipainoisuustutkimusta Janne Valkeapää Ohjaaja: FT Baoru Yang ELINTARVIKEKEMIA Erikoistyöni on osa tutkimushanketta, jossa tutkitaan ylipainoisuuden fysiologiaa ja ravinnon laadun vaikutusta sen synnyssä. Tässä esikokeessa käytettiin tutkimuseläiminä sikoja, jotka oli jalostettu elintarviketeollisuuden käyttöön. Kokeessa eläimet saivat ravintoa, jolla pyrittiin jäljittelemään ihmisravintoa etenkin ylipainoisuuden kannalta ratkaisevien tekijöiden, kuten rasvan ja sokerin osalta. Kasvatuksen päätyttyä eläimistä tutkittiin ihon alaisen ja sisäelimiin kertyneen rasvan laatua. Kokeessa käytetyt eläimet kasvatettiin tavallisissa sikaloissa ja normaaliolosuhteissa. Eläimet oli jaettu neljään ryhmään, jotka saivat toisistaan poikkeavaa ravintoa. Ensimmäinen ryhmä söi sikojen suositusten mukaista ravintoa. Toinen ryhmä söi rasvapitoisuudeltaan alennettua ravintoa. Kolmas ja neljäs ryhmä saivat ravintoa, jolla pyrittiin eläinten lopullinen rasvaprosentti samaan painoprosenttiin. Myös erilaisia ruokailutottumuksia pyrittiin jäljittelemään lisäämällä rehuun joko sokeria tai kuitulähde. Teurastetuista eläimistä saaduista maksanäytteistä otettiin mahdollisimman edustava näyte, josta uutettiin lipidiliukoiset yhdisteet Folchin-menetelmän mukaisesti kloroformi-metanoli (2:1) seoksella. Uute fraktioitiin viiteen lipidiluokkaan: kolesteroliesterit, triasyyliglyserolit, vapaat rasvahapot, vapaa kolesteroli ja fosfolipidit. Fraktiot metyloitiin rasvahappojen metyyliestereiksi booritrifluoridi-menetelmällä, jonka jälkeen ne analysoitiin kaasukromatografilla. Tutkimus on vielä kesken mutta varhaisista tuloksista saatiin maksan rasvapitoisuudeksi 4-6 painoprosenttia (n = 86). Lipidiluokista suurin oli fosfolipidit, joiden suuri, noin 40 prosentin osuus voi selittyä rakeenteellisten fosfolipidien määrällä kudoksissa. Tutkimus jatkuu lidipiluokkien kromatografisella analyysilla, jolla etsitään muutoksia eri ruokintaryhmien lipidiprofiilissa. Asiasanat: kaasukromatografia, rasvahappo, sian maksa, ylipaino

33 «18» Dokosapentaeenihapon (DPA, 22:5n-3) ja eikosapentaeenihapon (EPA, 20:5n-3) aterianjälkeinen aineenvaihdunta ihmisissä Anu Nuora Ohjaajat: FT Kaisa Linderborg ja prof. Heikki Kallio ELINTARVIKEKEMIA Eikosapentaeenihapon (EPA, 20:5n-3), dokosapentaeenihapon (DPA, 22:5n-3) ja dokosaheksaeenihapon (DHA, 22:6n-3) aineenvaihduntaa ihmisissä on perinteisesti tutkittu sisällyttämällä aterioihin kalaöljyä tai hylkeen öljyä. Koska luonnon öljyt ovat rasvahappojen seoksia, rasvahappojen biokonversiota on ollut vaikea tulkita. Tämän erikoistyön tarkoituksena oli tutkia ja verrata DPA:n ja EPA:n aterianjälkeistä aineenvaihduntaa ihmisissä. Suurin mielenkiinto kohdistui kylomikronien triasyyliglyserolien ja fosfolipidien pitkäketjuisten, tyydyttymättömien n-3- rasvahappojen pitoisuuksiin. Kaksoissokotetussa vaihtovuorotutkimuksessa kymmenen koehenkilöä nautti kukin kolme erilaista aamiaista. Aamiaiset sisälsivät joko pelkkää oliiviöljyä 20 g (kontrolli) tai 18 g oliiviöljyä ja 2 g joko EPA:a tai DPA:ta. Koehenkilöiltä otettiin verinäytteitä tunnin välein viiteen tuntiin asti. Kylomikronit eristettiin ultrasentrifugoimalla ja niiden rasva uutettiin Folch:n uutolla. Saatu lipidiseos fraktioitiin kiinteäfaasikromatografialla kolesteroliestereihin, triasyyliglyseroleihin ja fosfolipideihin. Rasvahapoista muodostettiin metyyliestereitä natrium metoksidi menetelmällä. Rasvahappojen metyyliesterit analysoitiin kaasukromatografisesti (Shimadzu GC-2010, AOC-20i autoinjektori, detektorina liekki-ionisaatio.) Kolonnina oli 60 metrinen DB-23 avoputkikolonni. Ravinnon EPA ja DPA kuljetettiin aterian jälkeen pääasiassa kylomikronien TAG:eissa. Ravinnon EPA nosti DPA:sta poiketen EPA:n määrää fosfolipideissä yhdestä kolmeen tuntiin aterian jälkeen. Triasyyliglyseroleissa ravinnon EPA nosti EPA:n määrää ja ravinnon DPA nosti DPA:n määrää yhdestä viiteen tuntiin aterian jälkeen. EPA:n ja DPA:n aterianjälkeinen biokonversio DHA:ksi oli vähäistä sekä triasyyliglyseroleissa että fosfolipideissä. Tutkimuksen tulokset vahvistavat monityydyttymättömien rasvahappojen saannin tärkeyttä ravinnosta alpha-linoleenihapon saannin rinnalla. Jatkossa omega 3 -sarjan rasvahappojen biokonversiota pitäisi tutkia ihmisessä myös pidemmän aikavalin tutkimuksella. Asiasanat: DPA, EPA, DHA, triasyyliglyseroli, fosfolipidi, biokonversio

34 «19» Monianalyyttimääritys lateraalivirtausalustalla Anni Spangar Ohjaajat: FM Etvi Juntunen ja prof. Kim Pettersson MOLEKULAARINEN BIOTEKNIIKKA JA DIAGNOSTIIKKA Immunokromatografisia määrityksiä eli lateraalivirtausmäärityksiä käytetään yleisesti pikatesteissä. Lateraalivirtausmääritykset ovat helppokäyttöisiä ja edullisia, joten ne sopivat hyvin potilasläheiseen testaukseen esimerkiksi kehittyvissä maissa. Erikoistyön tavoitteena oli tutkia ja kehittää lateraalivirtauslastulla tehtävää monianalyyttimääritystä, jonka avulla yhdestä näytteestä havaitaan samanaikaisesti HIV- ja hepatiitti B -virusinfektiot. Hepatiitti B -virus (HBV) ja HI-virus (HIV) ovat veriteitse tarttuvia viruksia, jonka vuoksi on tärkeää seuloa esimerkiksi luovutettu veri infektioiden havaitsemiseksi. Määrityksessä käytetyt merkkiaineet ovat hyvin erilaisia. HIV-määrityksessä tunnistetaan infektion aiheuttamaa humoraalista vastetta, eli virusta vastaan muodostuneita vasta-aineita. HBV-määrityksessä tunnistuskohteena puolestaan on hepatiitti B -viruspartikkelin pinta-antigeeni (HBsAg). Lateraalivirtauslastun HBVtestiviivana käytettiin streptavidiinin (SA) ja HBsAg:ta tunnistavan biotinyloidun anti- HBsAg-vasta-aineen kompleksia. HIV-testiviivana käytettiin SA:n ja HIV-vasta-aineita sitovan biotinyloidun rekombinanttisen HIV-kuoriproteiinin kompleksia. HBV havaittiin anti-hbsag-vasta-aineella ja HIV puolestaan HIV-kuoriproteiinilla päällystetyillä Eu-nanopartikkeleilla. Europiumin fluoresenssi mitattiin aikaerotteisesti skannaavalla mittaustavalla. Monianalyyttimäärityksen haasteita ovat mm. reagenssien ristireagointi ja sopivien määritysolosuhteiden löytäminen yhdistettäessä yksittäiset määritykset. Erikoistyössä kehitetyssä HIV-HBV-monianalyyttimäärityksessä sitojien ristireagointi ei aiheuttanut merkittävää ongelmaa. Molemmille analyyteille sopiva näytemäärä sen sijaan on hyvin tärkeä, koska HBV-antigeenin pitoisuudet seerumissa voivat olla hyvin alhaiset, jolloin näytettä tulisi olla paljon. Toisaalta näytemäärä ei saa olla liian suuri, koska HIV-vastaaineita sitova antigeeni oli hyvin hydrofobinen, mikä aiheutti proteiinien epäspesifistä sitoutumista HIV-testiviivaan näytemäärää lisättäessä. Asiasanat: Hepatiitti B, HIV, lateraalivirtausmääritys, monianalyyttimääritys

35 «20» Dengue-1-viruksen immunodominanttien epitooppien identifiointi faaginäyttötekniikalla Erica Kuusela Ohjaajat: FT Gaurav Batra ja FT Urpo Lamminmäki MOLEKULAARINEN BIOTEKNIIKKA JA DIAGNOSTIIKKA Flaviviruksiin kuuluva dengue-virus on yleinen taudinaiheuttaja erityisesti trooppisilla alueilla. Vuosittain tartunnan saa jopa 100 miljoonaa ihmistä. Primääri-infektiossa virus aiheuttaa lieviä, flunssan kaltaisia oireita, kun taas sekundääri-infektio voi johtaa hengenvaaralliseen verenvuotokuumeeseen tai shokkitilaan. Tehokkaan hoidon takaamiseksi, ja toisaalta veripankkinäytteiden puhtauden varmistamiseksi, nopea ja luotettava serodiagnostiikka on tarpeen. Dengue-virusta on neljää eri serotyyppiä, jotka ovat hyvin samankaltaisia myös muiden flavivirusten kanssa. Samankaltaisuus aiheuttaa vasta-aineiden ristireaktiivisuutta. Ongelmana diagnostiikan kehittämisessä onkin kaikkien dengue-serotyyppien tunnistaminen ja toisaalta erottaminen muista flaviviruksista. Erikoistyön tavoitteena oli selvittää dengue-1-serotyypin spesifiset immunodominantit epitoopit faaginäyttötekniikalla. Tieto serotyyppispesifisistä epitoopeista edesauttaa paitsi serodiagnostiikan myös rokotteen kehittämistä. Erikoistyössä valmistettiin kaksi eripituisia fragmentteja sisältävää genomifragmenttifaaginäyttökirjastoa pilkkomalla viruksen genomi sattumanvaraisesti entsymaattisesti. Fragmentit liitettiin faaginäyttövektoreihin, jotka edelleen transformoitiin E. coli -soluihin. Näin dengue-1-viruksen proteiinit saatiin esiteltyä peptidifragmentteina filamenttifaagien pinnalla. Kirjastojen laadun analysoimiseksi sekvensoitiin sattumanvaraisesti valittuja faagiklooneja. Toisen kirjaston toimivuus testattiin selekoimalla sitä dengue-1-virusta tunnistavalla monoklonaalisella vastaaineella ja sekvensoimalla rikastuneita klooneja. Tämän jälkeen kirjastoa selekoitiin dengue-kuumepotilaiden ja rokotetutkimukseen osallistuneiden henkilöiden seeruminäytteillä spesifisten epitooppien löytämiseksi. Satunnaiskloonien sekvensointitulokset osoittivat kirjastojen kattavan tasaisesti koko fragmentoidun genomin. Monoklonaalisella vasta-aineella selekoidut ja sekvensoidut kloonit sisälsivät vasta-aineen tunnistaman oikean epitoopin. Niinpä kirjaston toimivuus on osoitettu. Spesifisten epitooppien identifiointi on kesken. Asiasanat: dengue-virus, genomifragmenttikirjasto, faaginäyttötekniikka, diagnostiikka