TEKSTIILIVÄRIEN KROONISET, MONEN SUKUPOLVEN HAITTAVAIKUTUKSET VESIKIRPUSSA (DAPHNIA MAGNA) ENNI HUOTARI

Transkriptio

1 TEKSTIILIVÄRIEN KROONISET, MONEN SUKUPOLVEN HAITTAVAIKUTUKSET VESIKIRPUSSA (DAPHNIA MAGNA) ENNI HUOTARI

2 UNIVERSITY OF EASTERN FINLAND Department of Environmental and Biological Sciences HUOTARI, ENNI: Chronic multigenerational effects of textile dyes on Daphnia magna MSc. thesis, 33 p. April (Key words: Textile dyes, chronic ecotoxicity, Daphnia magna) Textile industry is one of the most polluting industries in the world. It uses variety of chemicals, textile dyes being one of the most harmful ones. Still, part of the effluents from textile factories are released to surrounding waterways without any or adequate treatment. This master thesis research studied chronic, multigenerational effects on Daphnia magna of two textile dyes which are sold in supermarkets, focusing on reproduction and growth effects. Studied textile dyes are reactive dyes, which are designed to be non biodegradeble and stable in fabric, Reactive red 180 and Reactive blue ver These dyes are commonly used for dying cotton. Both acute and chronic methods were used to study ecotoxicity of the dyes. Acute toxicity test was performed to find suitable concentration for chronic test, which means concentration that does not show acute toxicity. Two chronic tests were performed. The first chronic test ended after F1 generation due to high mortality rate probably because of too warm temperature in the test room. Thus, there were not enough new-born daphnids to continue to next generation. During chronic tests, reproduction, size of mother daphnids, mortality, sex and number of ephippias were observed and measured. Number of offspring was recorded daily and size of mother daphnids was measured after each generation. Neither of the dyes showed acute toxicity in any exposure concentration. One observation was that the growth was reduced with the successive generations in this test setup in control and exposure groups. The second chronic test exposure of reactive blue ver 2108 caused changes in reproduction and growth. Daphnids that were exposed to dye were bigger and reproduced more than daphnids in control group. This can be explained for example by hormesis, which means that in low concentrations harmful substance causes the opposite effect than in high concentrations. Hormetic effect can seem to be beneficial for the population e.g because of increased reproduction or bigger body size. This research was not able to go further than F2-generation. Analysis of more generations is necessary before it is possible to make conclusions about harmfulness of these textile dyes.

3 ITÄ-SUOMEN YLIOPISTO Ympäristö- ja biotieteiden laitos HUOTARI, ENNI: Tekstiilivärien krooniset, monen sukupolven haittavaikutukset vesikirpussa (Daphnia magna) Pro gradu - tutkielma, 33s. Huhtikuu (Avainsanat: Tekstiilivärit, krooninen ekotoksisuus, Daphnia magna) Tekstiiliteollisuus on yksi saastuttavimmista teollisuudenaloista. Sen käytössä on monenlaisia erilaisia kemikaaleja, joista tekstiilivärit ovat haitallisimpien joukossa. Tekstiilitehtaista pääsee käsittelemättömiä tai puutteellisesti käsiteltyjä vesiä ympäröiviin vesistöihin. Tässä gradututkimuksessa tutkittiin kahden marketeissa saatavilla olevan tekstiilivärin kroonisia, monen sukupolven haittavaikutuksia vesikirpun (Daphnia magna) lisääntymiseen ja kasvuun. Värit olivat tyypillisesti puuvillan värjäykseen käytettyjä biohajoamattomiksi ja pysyviksi suunniteltuja reaktiivivärejä, Reactive red 180 ja Reactive blue ver Tekstiilivärien haitallisuutta tutkittiin akuutein ja kroonisin kokein. Akuutteilla toksisuuskokeilla etsittiin sopiva pitoisuus kroonisia kokeita varten, eli pitoisuus joka ei aiheuttanut akuuttia toksisuutta. Kroonisia kokeita suoritettiin tutkimuksen aikana kaksi. Ensimmäinen koe loppui F1-sukupolveen suuren kuolleisuuden vuoksi, jonka syynä oli luultavasti koehuoneen liian korkea lämpötila. Seuraavaa sukupolvea varten ei kuolleisuuden takia syntynyt tarpeeksi vesikirppuja. Kroonisten kokeiden aikana seurattiin vesikirppujen lisääntymistä, emokirppujen kokoa sekä kuolleisuutta, sukupuolijakaumaa ja lepomunien määrää. Syntyneiden poikasten määrä laskettiin päivittäin ja emojen pituus mitattiin kunkin sukupolven päätteeksi. Kummankaan värin kohdalla ei havaittu akuuttia toksisuutta missään altistuspitoisuudessa. Kroonisissa kokeissa yhtenä huomiona oli vesikirppujen koon pieneneminen sukupolvien edetessä, sekä kontrollissa että altistussarjoissa. Toisessa kroonisessa kokeessa, jossa tutkittiin ainoastaan violettia väriä, huomattiin värin vaikuttavan vesikirppujen lisääntymiseen sekä kokoon. Värialtistuksessa kasvaneet vesikirput tekivät enemmän poikasia ja olivat isokokoisempia kuin kontrollisarjan vesikirput. Tämä voidaan selittää hormeesilla, eli haitallinen aine aiheuttaa pienissä pitoisuuksissa vastakkaisen vaikutuksen kuin suurissa pitoisuuksissa. Pienissä pitoisuuksissa aineen vaikutus voi näyttää eliötä hyödyttävältä vaikutukselta. Tämä tutkimus jatkui vain F2- sukupolveen asti, koska koe oli aikataulullisten syiden vuoksi päätetty lopettaa tähän sukupolveen. Useamman sukupolven analysointi on tarpeen ennen kuin näiden tekstiilivärien haitallisuudesta voidaan vetää suurempia johtopäätöksiä.

4 Sisällysluettelo 1. JOHDANTO Tutkimuksen tausta Tutkimuksen tavoitteet MATERIAALIT JA MENETELMÄT Tutkittavat kemikaalit Malliorganismi Daphnia manga Alustavat testit ja akuutit toksisuustestit Krooninen altistuskoe ja koeasetelma Analytiikka ja tilastolliset menetelmät TULOKSET Akuutit toksisuustestit Ensimmäinen krooninen koe Poikastuotanto Koko Sukupuolijakauma ja lepomunat Toinen krooninen koe Poikastuotanto Koko Sukupuolijakauma ja lepomunat TULOSTEN TARKASTELU Akuutit toksisuustestit Krooniset kokeet Poikastuotanto Koko Sukupuolijakauma ja lepomunat JOHTOPÄÄTÖKSET KIITOKSET LÄHDELUETTELO... 30

5 1. JOHDANTO 1.1 Tutkimuksen tausta Tekstiiliteollisuus on yksi saastuttavimmista teollisuudenaloista (UNECE 2018). Vaate -ja jalkineteollisuus tuottaa 5-10% vuosittaisista globaaleista hiilidioksidipäästöistä ja 20% globaaleista jätevesistä (Quantis 2018 & UNECE 2018). Suurimmat vaikutukset näkyvät tekstiilejä värjäävien tehtaiden ympäristössä. Vuonna 2017 suurimmat tekstiilivalmistajat ja -viejät olivat Kiina, EU-maat ja Intia (WTO 2018). EU-maista suurimpia tuottajia ovat Ranska, Italia, Saksa, Espanja ja Alankomaat. Tekstiiliteollisuus on kasvanut viime vuosien aikana ja samalla myös sen aiheuttama paine ympäristölle. Nykyään esillä on termi pikamuoti, jolla tarkoitetaan halpoja ja heikkolaatuisia vaatteita, joilla on lyhyt elinkaari. Tekstiiliteollisuuden suuri ympäristökuorma koostuu raaka-aineiden kuten puuvillan tuotannosta, sen kuluttamasta vedestä, kemikaalikuormasta ja jäteveden tuotannosta sekä vaikeudesta kierrättää tekstiilijätettä. Pikamuoti ja vaatteiden lyhyet elinkaaret kasvattavat tätä kuormitusta. Vaatteiden valmistus keskittyy edelleen halpatuotantomaihin, joissa jätevedenpuhdistamoiden menetelmät eivät välttämättä ole riittäviä poistamaan haitallisia aineita jätevedestä (Dey & Islam 2015). Tekstiilitehtaiden jätevesistä haasteellisinta on poistaa väriaineita, liuenneita kiintoaineita, suoloja, ja mahdollisia raskasmetalleja sekä neutraloida kemiallista hapenkulutusta (COD) ja happamuutta (ph) (Chen ym. 2005). Lisäksi puhdistamoiden toiminnan valvonta ei ole aina riittävällä tasolla (Idris ym & Haque 2017). Jätevedenpuhdistamoiden kapasiteetti tuleville vesimäärille voi myös olla riittämätön (Vacchi ym. 2017). Teollisuuden jätevesille, mukaan lukien tekstiiliteollisuuden jätevedet, asetetut raja-arvot vaihtelevat maittain suuresti (ZDHC 2015). Jäteveden väriä mitataan monessa maassa, mutta hajonta raja-arvoissa on suurta ja eri maissa käytetään erilaisia mittayksiköitä. Tämä vaikeuttaa jätevesien värillisyyden vertailua. Värillisyyden raja-arvot ilmoitetaan tyypillisimmin platina-koboltti -skaalassa (Pt-Co). Menetelmä sopii parhaiten, keltaisen väristen luonnollisten orgaanisten ainesten värjäämien vesien väriarvojen määritykseen ja sen skaala on välillä ppm (EPA Method 110.2). Intian ympäristölainsäädännössä teollisuuden jätevesille on yleinen standardi, jonka mukaan vedestä tulee poistaa väriä niin paljon kuin käytännössä on mahdollista (The Environment Protection rules 4

6 S.O.844(E) Schedule 6). Tekstiilitehtaille on asetettu raja-arvoksi 150 Pt-Co ja värejä valmistaville tehtaille raja-arvo 400 Pt-Co (Standards for discharge of effluents from textile industry 2016 & Environment Standards for Dyes and Dye Intermediate Industry 2014). Thaimaan nykyisen lainsäädännön mukaan pintavesiin vapautettavan käsitellyn veden väriarvo saa olla 300 ADMI (B.E ). ADMI -väriarvo vastaa Pt-Co -skaalaa ja sen kantaliuos, jota käytetään väriarvon määrityksessä, valmistetaan samalla tavalla (EPA method 110.1). Menetelmä sopii teollisuuden jätevesille, joiden väri eroaa keltaisesta. Jopa 20% tekstiilien värjäämiseen käytetyistä väreistä päätyy jäteveteen (Umbuzeiro ym. 2005). Tehtaat ovat vastuussa jätevesiensä käsittelystä. Ne voivat käsitellä ne itse tai johtaa vedet jätevedenpuhdistamoihin. Tehtaiden, jotka käsittelevät itse jätevedet tulee noudattaa päästörajoituksia, mutta käytössä olevilla menetelmillä näihin rajoituksiin ei aina päästä (Idris ym. 2007). Tekstiilivärejä on eri tyyppejä ja suurimmat haitat tekstiilitehtaiden jätevesissä aiheuttavat reaktiivivärit (Pang & Ahmad 2013). Tämä johtuu niiden heikosta kiinnittymisestä kuituun sekä moniosaisesta värjäysprosessista, jossa kiinnittymätön väri toistuvasti huuhdellaan pois (Khatri ym. 2015). Kiinnittymätön väri päätyy jätevesijärjestelmään. Tekstiilivärit on suunniteltu biohajoamattomiksi, koska niiden tarkoitus on pysyä vaatteessa (Chequer ym. 2013). Tämän vuoksi niiden poistaminen jätevedestä on vaikeaa ja värit voivat koitua ympäristössä ongelmaksi. Jätevedenpuhdistamoissa on käytössä yleensä mekaaninen, kemiallinen tai biologinen puhdistus tai näiden yhdistelmä (Vacchi ym. 2017). Nämä ovat taloudellisia vaihtoehtoja, mutta eivät riitä poistamaan vedestä kaikkia kemikaalijäämiä. Uusia menetelmiä värien poistoon kehitellään, mutta niiden ongelmana on kallis hinta ja tehtaiden erilaiset tarpeet puhdistukselle (Khatri ym. 2015). Epätäydellinen jätevesien puhdistus johtaa puhdistamattomien tai vaillinaisesti puhdistettujen jätevesien päätymiseen vastaanottaviin vesistöihin, joissa ne voivat aiheuttaa haittavaikutuksia sekä ympäristölle että ihmisille (Dey & Islasm 2015 & Vacchi ym. 2017). Monet tekstiilejä värjäävistä tehtaista sijaitsevat jokien läheisyydestä ja usein tehtaiden puhdistettu jätevesi lasketaan jokiin (Dey 2015 & Haque 2017). Jokivettä käyttävät ihmiset voivat näin altistua haitallisille kemikaaleille. Mutageenisiä ja karsinogeenisiä vaikutuksia on tutkittu esimerkiksi Brasilian Piracicabajoesta ja tutkimusten perusteella havaittiin haittoja ihmisten terveydelle (Vacchi ym. 2017). Väriaineiden saastuttamat vedet voivat haitata vesikasvien fotosynteesiä, koska valoa ei pääse väriaineiden vuoksi veteen tarpeeksi (Mostafa 2005). 5

7 Tekstiilien värjäämiseen käytetään happovärejä, reaktiivivärejä, dispersiovärejä, suoravärejä ja rikkivärejä. Osaa käytetään luonnonkuiduille ja osaa synteettisten materiaalien värjäämiseen. Selluloosapohjaisille kuiduille eniten käytetyt tekstiilivärit ovat reaktiivivärejä (OECD 2017). Tässä tutkimuksessa käytetyt värit ovat marketeista saatavilla olevia reaktiivivärejä. Markettiväriaineet ovat tarkoitettu kankaiden värjäykseen joko pesukoneessa tai liottamalla vaatetta vedessä. Värjäyksen jälkeen nämä tekstiilivärit päätyvät kunnalliseen jätevesijärjestelmään. Reaktiivivärit ovat vesiliukoisia värejä, joilla voidaan tuottaa laaja skaala erilaisia värisävyjä (Lewis 2014). Kaikkien värien kohdalla värjäämisprosessiin tarvitaan suuri määrä vettä (Hessel ym. 2007). Puuvillan värjääminen reaktiiviväreillä kuluttaa kaikista värjäysprosesseista eniten vettä (Khatri ym. 2015). Mikään tekstiilien värjäämiseen käytetty väri ei kiinnity täydellisesti materiaaliin, vaan osa väriaineesta pysyy aina liuenneena valmistusprosessi käytettyyn veteen. Reaktiiviväreillä on kaikista alhaisin kiinnittymisprosentti (50-90%), mikä tarkoittaa, että jopa puolet väristä päätyy jäteveteen (Khatri ym. 2015). Reaktiivivärit muodostavat kovalenttisen sidoksen reagoidessaan kuidun funktionaalisen ryhmän kanssa. Kovalenttinen sidos on vahva kemiallinen sidos, jonka vuoksi reaktiivivärit pysyvät hyvin tekstiilissä. Tekstiilivärien perusrakenne koostuu kromoforeista ja auksokromeista (Pang & Ahmad 2013). Kromofori on molekyylin osa, joka saa aikaan molekyylin värin. Auksokromi on molekyylin funktionaalinen ryhmä, joka vaikuttaa kromoforiin muuttaen absorboituvan valon aallonpituutta ja intensiteettiä (Chequer ym. 2013). Väriaineen rakenne ja funktionaaliset ryhmät vaikuttavat väriaineen kiinnittymiseen ja värin vahvuuteen (Siddiqua ym. 2017). Tekstiilien valmistuksessa niihin lisätään värin lisäksi paljon muita kemikaaleja, joiden tarkoitus on parantaa tekstiilin ulkonäköä ja kestävyyttä, estää ryppyyntymistä ja likaantumista sekä suojata tekstiiliä kosteudelta ja homeelta (KEMI 2014). Tekstiiliä ostettaessa on kuitenkin mahdotonta tietää sen todellinen kemikaalisisältö. Useat tekstiilivärit luokitellaan atsoväreihin niiden sisältämän atso-ryhmän (-N=N-) vuoksi. Atsovärit voivat hajotessaan muuntua karsinogeenisiksi ja mutageenisiksi aromaattisiksi amiineiksi. Tämän vuoksi aromaattisiksi amiineiksi muuntuvien atsovärien käyttöä rajoitettiin EU:n alueella vuonna 2002 (REACH EC 1907/2006). Aromaattisiksi amiineiksi hajoavia atsovärejä saa olla tekstiileissä korkeintaan 30ppm, jos tekstiili on käytössä suorassa ja pitkässä ihokontaktissa. Intiassa syöpää aiheuttavia atsovärejä on kielletty jo 1990-luvun lopulla (OECD 2002). Intia seuraa samoja rajoituksia aromaattisten yhdisteiden osalta kuin EU-maatkin. Myös 6

8 Vietnam asetti vuoden 2018 alusta lähtien raja-arvoja atsoväreille, jotka voivat muuntua karsinogeenisiksi aromaattisiksi amiineiksi (QCVN 21: 2017 / BCT & SGS NO. 186/17). Tekstiileissä saa Vietnamin ja Intian asetusten myötä olla korkeintaan 30mg/kg näitä aromaattisia amiineja, eli vastaava määrä kuin REACH-asetuksen mukaan. Myös käytössä olevista vaatteista irtoaa vielä pesun aikana kemikaaleja, ja etenkin väriä vielä useammankin pesukerran jälkeen (Luongo 2015). Pesun kautta ympäristöön kulkeutuvia tekstiilikemikaaleja on tutkittu toistaiseksi suhteellisen vähän eikä tarkasti tiedetä, minkälaisia vaikutuksia niillä on. Tässä tutkimuksessa käytettävät värit ovat kotitalouskäyttöön tarkoitettuja pesukonevärejä. Värjäysprosessi on erilainen, kuin teollisuudessa mutta pesukonevärjäyksessäkään kaikki väri ei tartu värjättävään tekstiiliin vaan osa siitä päätyy kunnalliseen jätevedenpuhdistukseen. 1.2 Tutkimuksen tavoitteet Tämä tutkimus keskittyi tutkimaan kahden vaatteiden värjäämiseen käytetyn markettiväriaineen haittavaikutuksia. Tutkimuksessa haluttiin: 1)selvittää tekstiilivärien akuutti haitallisuus vesikirpulle (Daphnia magna) 2) tutkia värien kroonista haitallisuutta monen sukupolven testeillä, sekä 3) saada lisää tietoa sukupolvia ylittävästä tutkimuksesta vesikirpuilla. Sukupolvia ylittävät kokeet vesikirpuilla ovat uusia ekotoksikologisessa tutkimuksessa, mutta antavat tarpeellista tietoa kemikaalien haittavaikutuksista. Vuoden aikana yhdessä järvessä voi olla jopa 30 sukupolvea ja kemikaalien vaikutukset voivat olla erilaisia sukupolvien edetessä (Piscia ym. 2015). 2 MATERIAALIT JA MENETELMÄT 2.1 Tutkittavat kemikaalit Tutkimuksessa käytettiin tekstiilien värjäykseen tarkoitettuja jauhevärejä, jotka ovat saatavilla marketeista. Tähän kokeeseen värit ostettiin Prismasta. Värit ovat Nitor-merkin valmistamia All in 7

9 one-tekstiilivärejä (valmistusmaa Ranska) ja valikoituivat mukaan siksi että molemmat sisältävät pakkausselosteen mukaan vain yhtä nimettyä väriainetta. Tutkimukseen valitut värit olivat violetti (reactive blue ver 2108) ja fuksia (reactive red 180) CAS-numero Reactive blue ver 2108:lla ei ole CAS numeroa. Molemmat värit ovat reaktiivivärejä, joita käytetään pääasiassa selluloosapohjaisten kankaiden ja kuitujen värjäämiseen. Niiden kiinnittyminen kankaaseen perustuu vahvaan kovalenttiseen sidokseen, jonka väriaine muodostaa kuidun kanssa. Kovalenttinen sidos on vahva kemiallinen sidos, minkä vuoksi reaktiviivärien pysyvyys vaatteessa on hyvä (Ghaly ym. 2014). Kovalenttinen sidos edistää myös pesun-ja valonkestävyyttä (Clark 2011). Reaktiivivärien etuna on myös suuri kirjo erilaisia värejä, minkä vuoksi niistä on tullut suosittuja. Reaktiivivärit koostuvat neljästä erilaisesta kemiallisesta ryhmästä: kromoforista, muita molekyylejä sitovasta ryhmästä (bridging group), kuituihin reagoivasta ryhmästä (fibre-reactive group) ja veteen liukenevasta ryhmästä (water solubilising group) (Christie 2001). Monet reaktiivivärit kuuluvat atsoväreihin, erityisesti punaiset, keltaiset ja oranssit sävyt. Atsoväreihin kuuluvissa väreissä on vähintään yksi atsoryhmä (-N=N-). Atsoryhmä toimii reaktiivivärin kromoforina. Kromoforina voi olla myös karbonyyliryhmä tai ftalosyaniini. Reaktiiviväreissä on yksi tai kaksi reaktiivista ryhmää (fibre-reactive group), useimmissa reaktiiviväreissä on kaksi reaktiivisuuden parantamiseksi. Väriainetta, jossa molemmat reaktiiviryhmät ovat samanlaisia, kutsutaan homobifunktionaaliseksi ja väriainetta, jossa reaktiiviset ryhmät ovat erilaisia, kutsutaan heterobifunktionaaliseksi (Khatri ym. 2015). Tyypillisimmät reaktiiviset ryhmät ovat klooritriatsiini -ja vinyylisulfoni vinylryhmät (Ghaly ym & Khatri ym. 2015). Bridging group on yleisimmin aminoryhmä (-NH-) (Christie 2001). Water solubilising -ryhmä parantaa värin vesiliukoisuutta, tämä ryhmä on yleisimmin jokin sulfonaatti. Lisäksi lähes kaikki tekstiilivärit sisältävät raskasmetalleja (Ghaly ym & Verma 2008). Reaktiiviväreissä yleisimmät metallit ovat kupari, kromi ja lyijy (Verma 2008). All-in-one Nitor-tekstiilivärit sisältävät väriaineen lisäksi kiinnitysaineen ja suolan. Suola edistää värin kiinnittymistä kuituun (Talukder ym. 2017). Violetissa väriaineessa suolana on dinatriummetasilikaatti ja punaisessa natriummetasilikaatti. Reactive blue ver 2108 kemiallinen nimi on: 6,13-dichloro-3,10-bis{[2-({[(2-chloroethyl)sulfonyl]alkanoyl}amino)ethyl]-amino}- polycarboheterocyclo 4,11-disulfonic acid, mono and/or disodium salt and 6,13-dichloro-3-{[2-8

10 ({[(2-chloroethyl)sulfonyl]alkanoyl}amino) ethyl]amino}-10-[(2-{[4- (ethenylsulfonyl)alkanoyl]amino}ethyl)amino] polycarboheterocyclo -4,11-disulfonic acid Rakennekaavaa violetille väriaineelle ei löytynyt. ECHA:n tietokannassa väri löytyy nimellä blue ver 2108 (ECHA 2014a). Reaktiivipunainen 180 kemiallinen nimi (ECHA 2014b): 5-(benzoylamino)-4-hydroxy-3-[[1-sulpho-6-[[2-(sulphooxy)ethyl]sulphonyl]-2- naphthyl]azo]naphthalene-2,7-disulphonic acid, sodium salt. KUVA 1. Rakennekaava Reactive red 180 Reaktiivipunainen 180 sisältää yhden atsoryhmän (-N=N-), jolloin se luokitellaan atsoväreihin (kuva 1). Molempien väripakkausten kyljessä on varoitusmerkit syövyttävä sekä huutomerkki (vaarallinen/ haitallinen otsonikerrokselle). Molemmissa väripaketeissa on mainittu lisäksi varoituksia ärsyttää ihoa sekä vaurioittaa vakavasti silmiä. Punaisen värin paketissa on myös mainintana allergisen ihoreaktion mahdollisuus ja violetin värin paketissa mainintana saattaa aiheuttaa hengitysteiden ärsytystä. 9

11 2.2 Malliorganismi Daphnia manga Tässä tutkimuksessa käytettiin malliorganismina vesikirppua (Daphnia magna), jota käytetään laajasti ekotoksisuuden mittaamisessa. Ne sopivat ekotoksisiin testeihin, koska eläinplankton, kuten Daphnia:t, ovat tärkeitä ravintoketjujen kannalta, niitä on monissa vesiympäristöissä, ne ovat herkkiä kemikaaleille ja niiden kasvattaminen ja ylläpitäminen laboratorioissa on helppoa (Siciliano & Gesuele 2013). Daphnia- suvun vesikirput ovat makean veden äyriäisiä, joita on yli 100 erilaista lajia. Vesikirput lisääntyvät suvuttomasti ja hyvissä olosuhteissa populaatiossa ei ilmene koiraita ollenkaan (Ebert 2005). Alkiot kehittyvät poikasiksi sikiökammiossa, jossa ne ovat noin kolme päivää. Tämän jälkeen ne vapautuvat emosta ulos aikuisen kaltaisina. Epäotollisissa olosuhteissa vesikirput tuottavat lepomunia, ephippioita (Ebert 2005). Näissä lepomunissa on kova musta kuori ja ne sisältävät 0-2 alkiota. Lepomunien tarkoitus luonnossa on suojata alkioita ja kannan jatkumista talven yli. Yliopiston kasvatushuoneessa lepomunia ilmenee myös talven aikana, vaikka olosuhteet (valo ja lämpötila) ovat koko ajan samanlaiset. Lepomunat kertovat siis siitä, että ympäröivissä olosuhteissa on jotain vialla. Vesikirppujen lisääntyminen on normaalisti partenogeneettistä eli suvutonta lisääntymistä. Hyvissä olosuhteissa naaraat tuottavat diploideja munia, joista kehittyy lähes aikuisen näköisiä naaraspoikasia poikaspussissa. Ensimmäisten munien syntymiseen menee yleensä 8-13 päivää (Ebert 2005). Aika voi olla pidempi, jos ravinto on heikkoa tai sitä on liian vähän. Ensimmäisen poikueen jälkeen naaras voi synnyttää uuden poikueen 3-4 päivän välein. Optimaalinen happamuus vesikirppujen kasvulle ja lisääntymiselle on ph ph on vielä hyväksyttävän ph:n väli, jossa vesikirput pystyvät elämään. Tutkimuksessa käytetyt vesikirput olivat Itä-Suomen yliopiston ekotoksikologian kasvatushuoneesta. Vesikirppuja pidetään siellä jatkuvassa kasvatuksessa ja niiden määrää säädellään tutkimustarpeen mukaan. Kirppujen kasvatusvesi vaihdetaan kerran viikossa ja lisäksi kirppupoikaset seulotaan uuteen kasvatusaltaaseen ja aikuiset kirput omaansa viikoittain. Vesikirppuja ruokitaan kolme kertaa viikossa levällä, jossa päälaji on Scenedesmus. Ruokintamäärä on 1ml/50ml. Myös levä kasvatetaan Itä-Suomen yliopiston ekotoksikologian kasvatushuoneessa. 10

12 Vesikirppukokeita varten on useita standardeja, joiden mukaan tehdään kasvu- ja lisääntymiskokeita. Vesikirppujen lisääntymisstrategian vuoksi kokeissa on tärkeää määrittää koiraiden ja naaraiden määrä. Sukupuolet erotettiin toisistaan pään suuosan rakenteen perusteella. Koirailla on pari pidentyneitä antenneja, naarailla nämä ovat lyhyet (kuva 2). Kuva 2. Daphnia magna -naaras vasemmalla ja Daphnia magna -koiras oikealla. Kokeita varten valittiin alle 24 tunnin aikana syntyneitä poikasia. Kokeen aloitusta edeltävänä päivänä valittiin emoja, joilla näkyi munia ja nämä siirrettiin erilliseen kasvatusastiaa. Alle 24 tunnin päästä laskettiin poikasten lukumäärä silmämääräisesti ja koe aloitettiin, jos poikasia oli tarpeeksi. 2.3 Alustavat testit ja akuutit toksisuustestit Tutkimuksen aluksi tehtiin väriliuokset, joista seurattiin ph:n muutoksia sekä värijauheen sakkautumista veteen. ph:n muutoksia mitattiin noin 24 ja 48 tunnin jälkeen liuoksen tekemisestä. Mahdollista sakkautumista seurattiin silmämääräisesti. Kantaliuokset tehtiin mittaamalla 2g värijauhetta yhteen litraan milliporevettä ja sekoittamalla magneettisekoittimella. 11

13 Ennen varsinaisten kasvu -ja lisääntymiskokeiden alkua testattiin tutkittavien kemikaalien vaikutusta testiveden ph:n. Tarkoituksena oli seurata testiolosuhteiden säilymistä optimaalisina. 0,1mg/l, 1mg/l, 10mg/l ja 100mg/l laimennokset tehtiin kantaliuoksista (2g/l) milliporeveteen. Laimennosten ja kantaliuoksen ph tasapainotettiin natriumhydroksidilla (NaOH) ja vetykloridilla (HCl) optimaaliseksi (ph 7,2). Samat laimennokset tehtiin Elendt M7 -kasvatusveteen OECD:n standardin 211 mukaisesti (OECD 2012). M7-vesi puskuroi ph:n nousua ja veden ph pysyi tasaisena alustavassa kokeessa. M7-vesi soveltui näin myös koeasetelmaan, jossa ph:n tuli pysyä tasaisena viikon ajan. Tutkimuksen aluksi tehtiin akuutit toksisuustestit (OECD 202) akuutin toksisuuden mittaamiseksi sekä sopivien pitoisuuksien löytämiseksi krooniseen kokeeseen, eli pitoisuudet, jotka eivät aiheuta akuuttia toksisuutta. Akuuteissa toksisuustesteissä käytettiin sekä punaisesta että violetista väriaineesta tehtyjä neljää eri pitoisuutta (0,1mg/l, 1mg/l, 10mg/l ja 100mg/l). Näiden lisäksi käytettiin yhtä kontrollisarjaa M7-kasvatusvedestä. Jokaisessa sarjassa oli neljä rinnakkaista koeastiaa ja jokaisessa koeastiassa oli viisi vesikirppua. Vesikirput olivat alle 24h tunnin ikäisiä. Liikkumattomat vesikirput laskettiin 24h ja 48h kohdalla. Akuuteissa toksisuuskokeissa koeastioihin mitattiin ensin 20 ml väriliuosta eri pitoisuuksin, ja jokaisesta pitoisuudesta tehtiin neljä replikaattia. Tämän jälkeen jokaiseen koeastiaan laitettiin viisi alle 24 tunnin aikana syntynyttä poikasta. Kontrollisarjassa oli 20 ml M7-kasvatusvettä. Koe toteutettiin akuutin toksisuuskokeen standardin mukaan (OECD 202). Koe suoritettiin Itä-Suomen yliopiston ekotoksikologian tutkimushuoneessa, jossa valojakso oli 8:16h. Vesikirppujen liikkumattomuutta tarkastettiin ensimmäisen kerran 24 h kohdalla ja toisen kerran 48 h kohdalla. 2.4 Krooninen altistuskoe ja koeasetelma Akuuttien toksisuuskokeiden jälkeen aloitettiin krooninen, usean sukupolven tutkimus. Kroonisella kokeella tarkoitetaan tässä yhteydessä vuorokauden mittaista koetta, jossa vesikirput elävät jatkuvassa altistuksessa ja kokeen aikana syntyy useampi sukupolvi. Kemikaalipitoisuus pysyi jatkuvassa altistuskokeessa samana läpi kokeen. Tutkimus tehtiin jatkuvan altistuksen lisääntymiskokeen standardia (OECD 211) mukaillen. Usean sukupolven 12

14 Daphnia-kokeista ei ole vielä olemassa erillistä standardia. Kroonisessa kokeessa altistuspitoisuutena oli 1mg/l, koska se ei ollut akuutisti toksinen ja väriä ei pystynyt silmin havaitsemaan vedestä. Kroonisia kokeita tehtiin yhteensä kaksi. Ensimmäisessä kokeessa tutkittiin sekä punaista että violettia väriä ja toisessa vain violettia. Molemmissa kokeissa käytetiin alle 24 tunnin aikana syntyneitä vesikirpun poikasia. Ensimmäisen kokeen suuri kuolleisuus esti sukupolvien jatkumisen F1-sukupolven jälkeen, minkä takia suoritettiin toinen koe. Jälkimmäisessä kokeessa tutkittiin vain yhtä väriä, koska kahta altistussarjaa varten ei syntynyt tarpeeksi vesikirppuja. Laitoksella kasvatettava pysyvä vesikirppupopulaatio oli heikkokuntoinen ja uusia poikasia syntyi vähän työn ajankohdasta johtuen. Kahteen altistussarjaan ja kontrollisarjaan olisi tarvittu 60 poikasta, eikä näin montaa poikasta syntynyt saman vuorokauden aikana. Aikataulullisten syiden vuoksi koe täytyi aloittaa pian, joten ei voitu odottaa vesikirppupopulaation parempaa kuntoa. Poikasia syntyi riittävästi kontrollisarjaa ja yhtä altistussarjaa varten ja koe päätettiin aloittaa. Jokaista sarjaa, yhtä kontrollia ja kummastakin väristä yhtä altistussarjaa varten oli kymmenen vesikirpun poikasta, jotka laitettiin aluksi kasvamaan koeastiaan 250 ml tilavuuteen M7- kasvatusvettä (kuva 3). Kun vesikirpuilla havaittiin munia, munalliset vesikirput siirrettiin kasvamaan yksittäin 50 ml tilavuuteen, missä ne elivät koko loppukokeen ajan. Vesikirppuja ruokittiin levällä joka toinen päivä. Vitamiinilisän ja ruokinnan tarkoitus oli luoda kokeen ajaksi hyvät olosuhteet vesikirpuille, jotta partenogeneettinen lisääntyminen olisi mahdollista. Kuva 3. Kokeen eteneminen. Jokaista sarjaa varten oli 10 alle 24h aikana syntynyttä vesikirpun poikasta. Altistussarjoissa värin pitoisuus oli 1 mg/l. 13

15 Uusi sukupolvi muodostettiin, kun edellisessä sukupolvessa oli vähintään 10 saman vuorokauden aikana syntynyttä poikasta. Ensimmäisiä poikasia ei tyypillisesti käytetä testeissä eikä niitä tässäkään kokeessa otettu mukaan, koska ne ovat usein herkempiä kuin seuraavat poikueet (OECD 211 & Campos ym. 2016). Lisäksi ensimmäiset poikueet voivat olla hyvin pieniä, vain muutaman poikasen kokoisia (Campos ym. 2016). Uusi sukupolvi pyrittiin aloittamaan kaikissa sarjoissa samana päivänä. Uudet poikaset siirrettiin kasvamaan 250ml tilavuuteen M7-kasvatusvettä ja niitä ruokittiin ja ylläpidettiin samoin, kun edellisiä sukupolvia (kuva 4). Ensimmäisessä kokeessa tehtiin molemmista väriaineista yksi altistussarja, jossa väriaineen pitoisuus oli 1mg/l. Lisäksi tehtiin kontrollisarja M7-kasvatusvedestä. Kaikissa käsittelyissä oli lisäksi b-vitamiinia (100 µl/litra) kuten kasvatushuoneen normaalissa ylläpidossakin. Kuva 4. Ensimmäisen kokeen koeasetelma. Jokaista sarjaa varten oli 10 vesikirppua, jotka kasvoivat aluksi yhdessä 250ml tilavuudessa M7-kasvatusvettä ja ensimmäisten munien havaitsemisen jälkeen emot siirrettiin kasvamaan itsekseen 50ml tilavuuteen. Altistussarjoissa väriaineen pitoisuus oli 1 mg/l. Kolmannen sukupolven aikana koehuoneessa oli ongelmia lämpötilan kanssa. Joinain päivinä lämpötila oli noin 17 C ja toisina päivinä saattoi nousta yli 25 C. Suurin mitattu lämpötila oli 26,9 C. Valojakso oli 16:8 h. Koe 2 suoritettiin kasvatuskaapissa, jolloin saatiin lämpötila pidettyä halutussa 20 C. (+/-1 C) (kuva 5). Muilta osin koeasetelma oli kokeen 1 kaltainen. Valoaika (16:8h) oli myös 14

16 kasvatuskaapissa sama kuin koehuoneessa. Ruokintamäärää vähennettiin F0-sukupolven jälkeen, koska levä kasvoi kasvatuskaapissa voimakkaammin. F1-ja F2-sukupolvissa ruokintamäärä oli 2ml/100ml. Kuva 5. Toisen kokeen koeasetelma. Tutkimuksen aikana kerran viikossa vaihdettiin noin puolet koeastioissa olevasta vesimäärästä, jotta kemikaalipitoisuus pysyisi kaikissa eri pitoisuuksissa tasaisenakoko kokeen ajan. Koeastioissa ei ollut päällä suojaa, jolloin niistä pääsi haihtumaan hieman vettä, joka korvattiin vesien vaihdon yhteydessä. Vesien vaihtoa varten joka viikko tehtiin uudet altistusvedet kantaliuoksesta. Altistusvesistä mitattiin ph (SCHOTT GERÄTE ph-meter CG822), ja tarvittaessa säädettiin ph 7,2:een. Vesien vaihdon yhteydessä mitattiin ph (WTW MultiLine P4) sekä ennen että jälkeen vaihdon. Näin voitiin seurata ph-tasoa kokeen aikana ja poissulkea poikkeavan ph:n vaikutus kokeen tuloksiin. Syntyneiden poikasten määrä laskettiin päivittäin ja niiden sukupuoli määritettiin. Jokaisesta koeastiasta poimittiin syntyneet poikaset pipetillä erilliseen astiaan. Tämän jälkeen poikaset siirrettiin pipetillä aluslasille pienessä vesimäärässä. Kaikkien poikasten sukupuoli tarkastettiin mikroskoopilla (Dialux 20) ja laskettiin tarkka poikasmäärä. Tämän jälkeen poikaset lopetettiin. Vesikirppujen sukupuoli määritettiin suuosan antenneista, jotka ovat naarailla lyhyet ja koirailla 15

17 selkeästi pidentyneet (kuva 2). Päivittäin tarkistettiin myös mahdollisten kuolleiden emojen määrä ja silmämääräisesti huomioitiin emojen liikkumista ja liikkumattomuutta. Yhtä sukupolvea kasvatettiin ensimmäisessä kokeessa viisi viikkoa (35 vuorokautta) ja toisessa kokeessa kolme viikkoa (21 vuorokautta). Jatkuvan altistuksen kokeissa tyypillinen kasvatusaika on vuorokautta, mutta ensimmäisessä kokeessa tutkimusaika venyi yhdellä viikolla. Toisessa kokeessa oli tiukka aikataulu ja 21 vuorokautta valittiin kasvatusajaksi, jotta oli mahdollista saada useampi sukupolvi. Sukupolvien jälkeen kaikkien elossa olleiden vesikirppujen koko mitattiin käyttäen Nikon SM2800-mikroskooppia. Koko mitattiin päästä vartalon perään asti. Häntää ei otettu huomioon. 2.5 Analytiikka ja tilastolliset menetelmät Altistuspitoisuus (1 mg/l) oli tarkoitus varmistaa kokeen aikana spektrofotometrillä. Erilaisia laimennoksia mitattiin ennen kokeen aloitusta mutta krooniseen kokeeseen valittu pitoisuus osoittautui niin pieneksi, ettei sitä voitu tarkastaa spektrofotometrilla. Laimennoksia yritettiin myös konsentroida, mutta tästäkään huolimatta mittaukset eivät onnistuneet. Tilastomenetelmänä käytettiin Mann-Whitneyn U-testiä. Testit tehtiin SPSS-ohjelmalla. Tuloksista analysoitiin poikasten määrä emoa kohden sekä emojen koko sukupolven päätteeksi. Eroja analysoitiin sekä käsittelyjen että sukupolvien välillä. Kuvat tehtiin käyttäen Microsoft Excel -ohjelmaa. Poikasten määrässä emoa kohden on otettu huomioon ainoastaan naaraspuoliset vesikirput, jotka olivat elossa poikastuotannon alkaessa. Koon tilastollisessa analyysissä on otettu huomioon ainoastaan naarapuoliset vesikirput, koska koiraat ovat tyypillisesti naaraita pienempiä (Ebert 2005). 16

18 3 TULOKSET 3.1 Akuutit toksisuustestit Sekä violetti että punainen väri olivat selkeästi havaittavissa pitoisuuksissa 10 mg/l ja 100 mg /l. Tästä alemmissa pitoisuuksissa väriä ei voinut silmin havaita. Kummankaan värin kohdalla ei havaittu akuuttia toksisuutta 24 tunnin eikä 48 tunnin kohdalla missään pitoisuudessa (Taulukko 1 & 2). Taulukko 1. Reactive blue ver 2018 akuutti toksisuus. Liikkumattomien vesikirppujen määrä on merkattu taulukkoon. Suluissa on koeastioissa olleiden vesikirppujen määrä, jos se poikkeaa viidestä. 24 h liikumattomat 48h liikkumattomat Konsentraatio (mg/l) A B C D A B C D Kontrolli ,1 0 1(6) (6) Taulukko 2. Reactive red 180 akuutti toksisuus. Liikkumattomien vesikirppujen määrä on merkitty taulukkoon. Suluissa on koeastioissa olleiden vesikirppujen määrä, jos se poikkeaa viidestä. 24 h liikkumattomat 48h liikkumattomat Konsentraatio (mg/l) A B C D A B C D Kontrolli 1 0 0(4) (4) 0 0, (4) (4)

19 Syntyneet poikaset % 3.2 Ensimmäinen krooninen koe Ensimmäisessä kroonisessa sukupolvia ylittävässä kokeessa ei löytynyt merkitseviä eroja käsittelyjen välillä poikastuotannossa eikä koossa. Sukupolvien välillä oli merkitsevä ero vesikirppujen koossa sekä kontrollissa, että punaisessa altistuksessa, p <0,05. Ensimmäisessä kokeessa F1-sukupolven kohdalla koeastioissa havaittiin munia emojen ulkopuolella molemmissa altistuksissa sekä kontrollissa. Kontrollissa munia näkyi emojen ulkopuolella 12 kpl, violetissa altistuksessa 20 kpl ja punaisessa altistuksessa 3kpl. Kaikki abortoidut munat havaittiin samana päivänä Poikastuotanto F0-sukupolvessa kontrollisarjan vesikirput alkoivat tuottaa poikasia 10. päivänä (kuva 6). Violetissa altistuksessa poikastuotanto alkoi myös 10. päivänä kokeen alusta, punaisessa altistuksessa poikastuotanto alkoi vasta 12. päivänä (kuva 6). Koe 1 Kumulatiivinen poikastuotanto F0-sukupolvi Päivä kokeen aloituksesta Kont F0 Pun F0 Viol F0 Kuva 6. Kumulatiivinen poikastuotanto F0-sukupolvessa. 18

20 Poikasten määrä (kpl) syntyneet poikaset % Koe 1 Kumulatiivinen poikastuotanto F1-sukupolvi Päivä kokeena aloituksesta Kontrolli F1 Punainen F1 Violetti F1 Kuva 7. Kumulatiivinen poikastuotanto F1-sukupolvessa. F1-sukupolvessa poikastuotanto alkoi violetissa altistuksessa 16. päivänä, punaisen värin altistuksessa 18. päivänä ja kontrollisarjassa 17. päivänä (kuva 7). F2-sukupolvea varten ei syntynyt tarpeeksi vesikirppuja. F1-sukupolvessa violetissa altistuksessa eläneistä vesikirpuista jäi eloon yksi vesikirppu. Kontrollisarjan vesikirpuista oli F1-sukupolven päätyessä elossa kolme yksilöä ja punaisessa altistuksessa eläneistä elossa oli kuusi vesikirppua. Koe 1 Poikasten määrä emoa kohden Kontrolli F0 Sukupolvi F1 Violetti Punainen Kuva 8. Poikasten määrä emoa kohden (F0 kontrolli 22,7±4,2; violetti 17,8±8,2; punainen 22,8±3,4. F1 kontrolli 4,1±5,4; violetti 3,5±7,1; punainen 9,3±4,8) F0 -ja F1-sukupolvissa. F0 kontrolli n=10, violetti n=10, punainen n=10. F1 kontrolli n= 10, violetti n=10, punainen n=7. 19

21 Pituus (mm) Poikasten määrän laskemisessa emoa kohden käytettiin elossa olleiden naaraiden määrää, kun poikastuotanto alkoi. Laskemisessa on käytetty emojen määränä 10 emoa kontrollin ja violetin värin osalta molemmissa sukupolvissa. F1-sukupolvessa punaisen värin kohdalla emojen määränä on käytetty seitsemää emoa, koska kolme emoista kuoli ennen poikastuotannon aloittamista. Tilastollista merkitsevyyttä ei ollut, vaikka laskennassa olisi käytetty 10 emoa. Poikasten määrässä emoa kohden ei ollut tilastollisia eroja kontrollien ja alistusten välillä (kuva 8). Sukupolvien välillä on tilastollisesti merkitsevä ero kaikkien sarjojen osalta. Kontrollissa p=0,001, violetissa p=0,002, punaisessa p=0, Koko Vesikirppuemojen koossa ei ollut tilastollisesti merkitsevää eroa (F0 p = 0,3 ja F1 0,5) kontrollin ja violetin altistuksen välillä eikä kontrollin ja punaisen altistuksen välillä (F0 p = 0,1 ja F1 p= 0,7) (kuva 9). Koe 1 emojen koko 4 3,9 3,8 3,7 3,6 3,5 3,4 3,3 3,2 3,1 F0 Sukupolvi F1 Kontrolli Violetti Punainen Kuva 9. Emojen koko F0 -ja F1 -sukupolvissa (F0 kontrolli 4±0,09; violetti 3,9±0,05; punainen 3,9±0,05. F1 kontrolli 3±0,06; violetti 3,7±0; punainen 3,5±0,05). F0 kontrolli n= 9, violetti n=8, punainen n=8. F1 kontrolli n=3, violetti n=1, punainen n=6. 20

22 Pituus (mm) Emojen koko 4,5 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 * * * * { { Kontrolli koe1 Violetti koe 1 Punainen koe1 Kontrolli koe2 Violetti koe2 Käsittely * { F0 F1 F2 Kuva 10. Vesikirppuemojen koko (mm) molemmissa kokeissa (Koe 1. F0 kontrolli 4±0,09; violetti 3,9±0,05; punainen 3,9±0,05. F1 kontrolli 3±0,06; violetti 3,7±0; punainen 3,5±0,05. Koe 2. F0 kontrolli 3,7±0,08; violetti 3,7±0,1. F1 kontrolli 3,5±0,1; violetti 3,6±0,09. F2 kontrolli 2,8±0,07; violetti 2,9±0,05). Ensimmäinen koe F0 kontrolli n=9, violetti n=8, punainen n=8. F1 kontrolli n=3, violetti n=1, punainen n=6. Toinen koe F0 kontrolli n=4, violetti n= 5. F1 kontrolli & violetti n=10, F2 F1 kontrolli & violetti n=10. Sukupolvien välillä on tilastollisesti merkitsevä ero kontrollisarjassa (p=0,01) sekä punaisessa altistuksessa (p=0,002) (kuva 10) Sukupuolijakauma ja lepomunat Kokeen aikana ei havaittu yhtään lepomunaa. Kaikki kokeen aikana syntyneet vesikirput olivat naaraita. 3.3 Toinen krooninen koe Toisessa kroonisessa kokeessa tutkittiin ainoastaan violetin värin vaikutuksia. Yhden sukupolven kesto oli 21 vuorokautta. Kokeen aikana huomattiin levän tarttuvan vesikirppujen uimaraajoihin ja osa vesistä oli selkeästi vihertyneitä (Kuva 5). Näissä vesissä oli myös korkeampi ph, kahdessa mittauksessa yli optimaalisen rajan (ph >8.5). Muissa mittauksissa ph oli 7,2-8,5. 21

23 Syntyneet poikaset (%) Syntyneet poikaset (%) Poikastuotanto F0-sukupolven poikastuotanto alkoi sekä altistuksessa että kontrollisarjassa 12. päivänä kokeen alusta (kuva 11). F1-sukupolvessa violetissa altistuksessa kasvaneet vesikirput alkoivat tuottaa poikasia 10. päivä ja kontrollissa kasvaneet vesikirput 13. päivä (kuva 12). F2-sukupolvessa violetissa altistuksessa kasvaneilla vesikirpuilla havaittiin munia sukupolven viimeisenä päivänä, mutta yhtään poikasta ei syntynyt. Tästä johtuen F3-sukupolvea ei voitu aloittaa Kumulatiivinen poikastuotanto F Kontrolli Violetti Päivä (laskettuna kokeen alusta) Kuva 11. Kumulatiivinen poikastuotanto F Kumulatiivinen poikastuotanto F Kontrolli Violetti Päivä (kokeen aloituksesta laskien) Kuva 12. Kumulatiivinen poikastuotanto F1-sukupolvessa. 22

24 Poikasten määrä (kpl) Koe 2 poikasten määrä emoa kohden * * Kontrolli Violetti 0 F0 Sukupolvi F1 Kuva 13. Poikasten määrä emoa kohden F0 -ja F1-sukupolvissa. (F0 kontrolli 21,8 ±7,8; violetti 23,2±1,4. F1 kontrolli 10,6±2,9; violetti 17,4±5,4). F0 kontrolli & violetti n=10. F1 kontrolli & violetti n=10. Poikasten määrässä emoa kohden on tilastollisesti merkitsevä ero kontrollin ja altistuksen välillä sekä F0- että F1-sukupolvissa, F0 p= 0,013 ja F1 p= 0,001 (kuva 13). F0-sukupolvessa syntyi enemmän poikasia kontrollisarjan vesikirpuille ja F1-sukupolvessa violetissa altistuksessa. Tilastollisesti merkitsevä ero havaittiin myös sukupolvien välillä kontrollisarjassa (p=0,008). F0-sukupolvessa oli mukana koiraita, eli jo kokeeseen valituista kirpuista osa oli koiraita. Kontrollisarjassa oli kuusi koirasta ja violetissa altistuksessa viisi. Koiraita ei ole otettu huomioon laskettaessa keskiarvoa poikasten määrälle per emo. Kontrollissa emoja oli kymmenen sijasta neljä ja violetissa altistuksessa kymmenen sijasta viisi. 23

25 Pituus (mm) Koko 4 3,5 3 Koe 2 emojen koko * * 2,5 2 1,5 Kontrolli Violetti 1 0,5 0 F0 F1 F2 Sukupolvi Kuva 14. Emojen koko F0-, F1- ja F2-sukupolvissa (F0 kontrolli 3,7±0,08; violetti 3,7±0,1. F1 kontrolli 3,5±0,1; violetti 3,6±0,09. F2 kontrolli 2,8±0,07; violetti 2,9±0,05). Tilastollisesti merkitsevä ero emojen koossa kontrollin ja altistuksen välillä F1-ja F2-sukupolvissa. F0 kontrolli n= 4, violetti n=5. F1 kontrolli & violetti n=10. F2 kontrolli & violetti n=10. Koossa havaittiin tilastollisesti merkitsevä ero käsittelyjen välillä F1- ja F2-sukupolvissa. F1- sukupolvessa p=0,023 ja F2-sukupolvessa p<0,0001 (kuva 14). F0-sukupolvessa ei ollut tilastollisesti merkitsevää eroa kontrollin ja altistuksen välillä. Koon pieneneminen sukupolvien edetessä oli tilastollisesti merkitsevä F0- ja F1-sukupolvien välillä kontrollissa (p=0,014) ja tilastollisesti merkitsevä F1- ja F2-sukupolvien välillä sekä kontrollissa että altistuksessa (p<0,0001) (kuva 10) Sukupuolijakauma ja lepomunat Koiraita havaittiin ainoastaan kokeen F0-sukupolvessa. Eli jo kokeeseen aluksi valituista poikasista osa oli koiraita. Kontrollissa oli kuusi koirasta ja violetissa altistuksessa viisi. Muissa sukupolvissa koiraita ei havaittu. Lepomunia ei havaittu kokeen aikana. 24

26 4 TULOSTEN TARKASTELU 4.1 Akuutit toksisuustestit Valituilla väriaineilla ei havaittu akuuttia toksisuutta. Reactive red 180:llä ei ole aiemmissa tutkimuksissa havaittu akuuttia toksisuutta altistuspitoisuuksilla 1mg/l 100mg/l (ECHA 2014b). Näillä pitoisuuksilla myöskään Reactive blue ver 2108:a ei ole havaittu akuutisti toksiseksi (ECHA 2014a). Reaktiivipunainen 120:lla tehdyissä vesikirppututkimuksissa EC50-arvoksi määritettiin 24 tunnin kohdalla 50,10 mg/l ja 48 tunnin kohdalla 10,40 mg/l (Darsana ym. 2015). Johtopäätöksenä oli, että alle 10 mg/l väripitoisuudet voivat olla haitallisia vesikirpuille. Reaktiivipunainen 120 sisältää klooria kuten violetti värikin. Klemola (2008) havaitsi reaktiivivärien toksisuutta solututkimuksissa. 4.2 Krooniset kokeet Tekstiiliväreillä ei ole tehty sukupolvia ylittäviä toksisuuskokeita, joten tuloksia on vaikea verrata muuhun tutkimustietoon. Tuloksia voidaan verrata muihin monen sukupolven tutkimuksiin ja akuutteihin ja kroonisiin tutkimuksiin tekstiiliväreistä. Ensimmäisessä kokeessa huomattiin abortoituja munia koeastioiden pohjalla. Munia huomattiin sekä kontrolleissa, että altistuksissa. Munien abortoinnin syistä ei ole olemassa yhteneväistä tutkimustietoa (Conde-Porcuna ym. 2011). Abortoitumisen syynä voivat olla haitalliset metallit esimerkiksi lyijy, liian vähäinen tai huonolaatuinen ravinto (Araujo ym & Conde-Porcuna ym. 2011). Kokeen ajan vesikirppuja ruokittiin joka toinen päivä viherlevällä kasvatushuoneen tapaan. Leväpitoisuutta ei kuitenkaan kokeen aikana mitattu, eli ravinnon laadusta ja riittävyydestä ei ole tuloksia. Lisäksi lämpötilan ja parasiittien vaikutusta abortointiin on tutkittu (Boersma & Vijverberg 1995). Conde-Porcuna ym. (2011) tutkimuksessa sekä lämpötilan alenemista että valoajan lyhentymistä verrattiin muuttumattomiin olosuhteisiin. Abortoituja munia ilmeni enemmän 25

27 muuttuvissa olosuhteissa, kuin pysyvissä olosuhteissa. Ensimmäisen kokeen aikana lämpötila vaihteli, sekä laski että nousi normaalista lämpötilasta. Toisessa kroonisessa kokeessa huomattiin veden vihertymistä eli levien kasvu oli suurempaa kuin normaalisti kasvatushuoneessa. Levän kasvuun vaikuttaa lämpötila, valon intensiteetti sekä säteilytysvoimakkuus (Singh & Singh 2015). Kasvatuskaapissa lämpötila ja valoaika olivat samanlaiset kuin kasvatushuoneen normaaliolosuhteissa. Valon intensiteetistä tai lamppujen tehosta ei ole tietoa. Kasvatuskaapissa lamput olivat lähempänä koeastioita kuin kasvatushuoneessa tai koehuoneessa, mikä vaikuttaa valon voimakkuuteen Poikastuotanto Värillä ei ollut ensimmäisen kroonisen kokeen perusteella vaikutusta vesikirppujen kykyyn tuottaa poikasia (kuva 8). Ensimmäisessä kroonisessa kokeessa F1-sukupolvessa syntyi huomattavasti vähemmän poikasia kuin F0-sukupolvessa. Tämä voi olla seurausta heikentyneistä olosuhteista lämpötilan osalta, koska samassa sukupolvessa lähes kaikki kirput kuolivat ja kuolleisuutta oli sekä kontrollissa että altistussarjoissa. Kuolleisuutta tapahtui ensimmäisessä kokeessa sekä kontrolleissa, että altistuksissa. Suurinta kuolleisuutta havaittiin ensimmäisen kokeen F1-sukupolvessa, erityisesti kontrollisarjassa. Tämä johtui mahdollisesti lämpötilan noususta. Koehuoneessa korkein mitattu lämpötila oli yli 25. Daphnia magna selviää elossa korkeissa, yli 30, lämpötiloissa (Kivivuori & Lahdes 1996). Daphnia magna:n elinaika voi kuitenkin lyhentyä normaalia korkeammissa lämpötiloissa (Hoefnagel ym. 2018). Korkealla lämpötilalla on havaittu olevan yhteys heikentyneeseen lisääntymiseen (Threlkeld 1979). Huomioitavaa on myös se, että vesikirput saattoivat vahingoittua, kun niitä siirrettiin uusiin astioihin, vaikka siirrot tehtiin varovaisesti pipetillä. Molemmissa kokeissa vesikirput siirrettiin uusiin astioihin samalla menetelmällä. Kumulatiivisessa poikastuotannossa huomataan vesikirpuille tyypillistä porrasmaisuutta lisääntymisessä (kuva 6 & 7). Vesikirput voivat tehdä ensimmäisen poikueen jälkeen uuden poikueen 3-4 päivän välein (Ebert 2005). F0-sukupolvessa poikasten määrä pysyi samana kaikissa käsittelyissä muutaman päivän ajan, minkä jälkeen uusi poikue taas syntyy. Sama nähdään F1- sukupolvessa erityisesti violetin käsittelyn kohdalla. 26

28 Usean sukupolven ekotoksisissa tutkimuksissa poikastuotannon on havaittu alkavan myöhemmin kemikaalialtistuksessa, ja kemikaalipitoisuuden noustessa myös lisääntymisen alkamisessa kesti pidempään (Chen ym. 2013). Myös poikueiden määrän emoa kohden on huomattu vähenevän. Toisessa kroonisessa kokeessa erot poikasten määrässä käsittelyjen välillä olivat tilastollisesti merkitseviä (kuva 13). F0-sukupolvessa poikasia syntyi enemmän kontrollisarjassa ja F1- sukupolvessa poikasia syntyi enemmän violetissa altistuksessa. Vesikirpuilla on havaittu kemikaalialtistuksissa hormeesia (Flaherty & Dodson 2005). Sama ilmiö on huomattu useilla eri kemikaaleilla ja useilla eri lajeilla (Stanley ym. 2013). Hormeesissa vesikirput lisääntyvät stressin takia pienissä pitoisuuksissa enemmän kuin kontrollissa mutta suurissa pitoisuuksissa vaikutus on päinvastainen (Stanley ym. 2013). Reaktio voi aluksi näyttää siltä, että eliö hyötyy kemikaalialtistuksesta. Hormeesissa eliön puolustusmekanismit käynnistyvät, vaikka haitallisia vaikutuksia ei vielä voida havaita (Calabrese & Baldwin 2002). Yksikään vesikirppu ei kuollut toisen kroonisen kokeen aikana, eli kaikki vesikirput pystyivät lisääntymään kokeen päättämiseen asti. F2-sukupolvessa ei syntynyt yhtään poikasta 21 vuorokauden aikana. Normaalisti ensimmäisten munien muodostumiseen menee 5-10 päivää 20 Cja hyvissä ravinto-olosuhteissa (Ebert 2005). Munasta tulee alkio noin yhdessä päivässä ja tämän jälkeen alkio kehittyy sikiökammiossa noin kolmen päivän ajan, minkä jälkeen se vapautuu kammiosta. Laskennallisesti uuden sukupolven aloittamiseen tarvitaan siis vähintään 12 vuorokautta, olettaen että ensimmäinen poikue syntyy yhdeksännen vuorokauden kohdalla ja seuraava poikue, josta uusi sukupolvi voidaan aloittaa, kolme vuorokautta tämän jälkeen Koko Ensimmäisessä kroonisessa sukupolvia ylittävässä kokeessa ei havaittu tilastollisesti merkitsevää eroa vesikirppujen koossa eri käsittelyjen välillä. Toisaalta F1-sukupolvessa vesikirppujen koko on keskimääräisesti pienempi kuin F0-sukupolvessa. Sukupolvien välillä ero on tilastollisesti merkitsevä kontrollissa ja punaisessa värissä (kuva 10). Pienempikokoiset jälkeläiset tuottavat vähemmän munia ja munat ovat pienempiä (Campos ym. 2016). Pienempikokoisilla jälkeläisillä myös kestää aikuistumisessa ja lisääntymisessä kauemmin. 27

29 Tällä voitaisiin selittää koon pienemistä kokeen edetessä. Kroonisten kokeiden aikana ei tässä tutkimuksessa mitattu syntyneiden poikasten pituutta, joten tuota yhteyttä ei voida tarkemmin käsitellä. Emoja oli F1-sukupolven päätteeksi elossa vain muutamia yksilöitä, joiden varaan koon laskeminen jäi. Lisäksi kokeen aikana oli lämpötilavaihtelua mikä voi vaikuttaa tuloksiin. Toisessa kokeessa käsittelyjen välillä oli tilastollisesti merkitsevä ero F1- ja F2-sukupolvissa (kuva 14). Violetissa altistuksessa kasvaneet olivat kooltaan suurempia. Ero oli suurempi F2- sukupolvessa. F0-sukupolvessa ei ollut kokoeroja, mutta otoskoko oli myös pienempi, koska sukupolvessa oli mukana koiraita. Koiraita ei otettu huomioon laskettaessa koon keskiarvoa. Pienissä kemikaalipitoisuuksissa hormeesi voi aiheuttaa kasvaneen lisääntymisen lisäksi yksilöiden isompaa kokoa (Stanley ym. 2013). Tällä voitaisiin selittää violetissa altistuksessa kasvaneiden vesikirppujen suurempi koko kontrollissa kasvaneisiin kirppuihin nähden. Koon havaittiin pienevän tutkimuksen edetessä kaikissa käsittelyissä myös tässä kokeessa (kuva 10). Tulokset ovat siis samansuuntaisia kuin ensimmäisessä kokeessa. Koska koko pieneni sekä altistuksissa että kontrolleissa, voidaan olettaa sen johtuvan kroonisesta koeasetelmasta ja sen aiheuttamasta stressistä. Vesikirpuilla on tehty jatkuvan altistuksen kokeita muilla kemikaaleilla, mutta näissä kokeissa ainoastaan kemikaalialtistuksen on huomattu aiheuttavan pienenemistä sukupolvien edetessä (Chen ym. 2013). Pieni koko voi johtua ravinnon huonosta laadusta (Steinberg ym. 2010). Levän määrää vähennettiin F0-sukupolven jälkeen, koska edellisessä sukupolvessa levä oli tarttunut vesikirppujen uimaraajoihin ja vesi oli huomattavan vihreää. Myös F2-sukupolvessa vedet olivat selkeästi vihertyneitä. Kun emot poimittiin mittausta varten, myös niiden uimaraajoihin oli tarttunut levää. Näin ollen ravinnon määrä voidaan olettaa olleen tarpeeksi suuri. Tietyt tekstiilivärit voivat olla myös levälle toksisia (Croce ym. 2017) Sukupuolijakauma ja lepomunat Kummankaan kroonisen kokeen aikana ei syntynyt yhtään koirasta eikä lepomunia havaittu kokeen aikana. Lepomunia ja koiraita ilmenee, kun olosuhteet eivät ole vesikirpulle sopivat (Ebert 2005). Ekotoksisissa kokeissa koiraita on havaittu esimerkiksi lääkeaineilla tehdyissä tutkimuksissa (Flaherty & Dodson 2005). Lepomunia havaitaan kevättalvella Itä-Suomen yliopiston 28